合成生物催化剂工程,摘译自:https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/synthetic-biology-brings-programmability-to-drug-programs/

“集成电路”一词不再局限于计算机芯片,“主板”一词也不再局限于计算机机箱,这些术语正被合成生物学家应用于生物系统。这些系统与计算机系统一样,应该是可编程的。目前,大多数合成生物学组件,如开关、振荡器、门控通路等,正用于重新设计并重新利用活细胞。一些改变用途的细胞正在应用于药物发现和开发中。有时,细胞是特别灵活和强大的生物医药生产平台。有时细胞本身就是药,也就是说,细胞是“活药”。
本文中的大多数见解都与已经用于开发治疗的工具和平台有关。
一套更大的CRISPR工具

Mammoth Biosciences通过筛选宏基因组数据搜索新的CRISPR系统。据Mammoth联合创始人兼CSO Lucas Harrington博士称,该公司拥有来自大量地点(包括火山、温泉和南极冰)、各种标本类型(包括动物粪便)和生物体(包括人类)的微生物的基因组学数据。他说,“挖掘新数据,供给新应用。”
Mammoth采用自上而下和自下而上的方法,为每个应用找到最佳CRISPR工具。例如,Mammoth使用“发现到应用”开发DETECTR系统。Mammoth的科学家发现,在某种Cas酶与向导RNA结合并发现DNA靶点后,它变成了一种非特异性切割工具,也可以切割报告分子。将荧光、比色或电信号作为报告分子,切割事件会提供实时结果,表明目标序列已被找到。
Mammoth最近表示,它正在为一项名为DETECTR BOOST的高通量、基于CRISPR的COVID-19测试准备Emergency Use Authorization(EUA)申请。该公司的管线中还在将其用于其他呼吸道病毒靶点。当前疫情需要区分流感、呼吸道合胞病毒和SARS-CoV-2等感染性病原体。
Mammoth的联合创始人兼首席技术官Janice Chen博士强调:“CRISPR分析的力量在于其灵活性。”“您可以将向导RNA编程跟踪不同的目标,多路复用同时检测不同的目标序列,并从单个样本中差异诊断。”
在治疗方面,最热的领域是寻找紧凑的CRISPR蛋白,如Cas14。传统的CRISPR蛋白质非常大,很难输送到所需的组织。
可编程细胞治疗的发现引擎
ArsenalBio高级总监Aaron Cooper博士说:“我们的集成电路修饰T细胞技术允许在T细胞癌症治疗中配置更多治疗功能。”“我们设计解决多个问题的多种功能,创建多维细胞治疗。”
ArsenalBio利用其PrimeR逻辑门、CARchitecture衍生基因表达控制和CellFoundry介导的非病毒制造平台来合成集成电路修饰的T细胞。集成电路包含多功能DNA,可用于编程T细胞去识别两种抗原,并且只有在两种抗原都存在时才能杀死肿瘤细胞。这种方法可以克服实体瘤的靶向困难,并减少脱靶效应。集成电路还可以调节T细胞生物学的各个方面,增加细胞增殖和效力,并提高对抑制性肿瘤微环境的抵抗力。
集成电路太大,无法用病毒递送,关键的挑战是将集成电路DNA递送到细胞中。Cooper解释说:“我们必须使用基于CRISPR的递送方法。”“它可以承载更多的DNA,并且实施起来更快。我们可以迭代,并快速测试、学习和构建。”
另一个挑战是安全。为了应对这一挑战,ArsenalBio确保DNA被插入基因组中远离任意一个基因的位点中。Cooper解释说:“能够选择一个位点意味着我们能够比与病毒或转座子的随机整合更能预测插入程序的动态。”“我们可以在许多T细胞样本中测试,并对我们将在体内看到的东西有高度的信心。”
AresenalBio一直在使用包含约8.3kb DNA的集成电路。
Cooper宣称:“进化将用于识别肿瘤的其他机制。”“有许多想法,我们需要开始一次执行多个单一治疗。遗传逻辑板可以让您同时追求多个方面,以便您可以解决抗原识别问题,延长治疗寿命,并设计药物,使其对肿瘤微环境中的抑制剂更具抵抗力。”
一对下一代药物发现平台

SyntheX有两个药物发现平台:ToRPPIDO和ToRNeDO。他们依靠功能性细胞内药物选择,而不是体外筛查。ToRPPIDO可以发现破坏细胞内特定蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)的化合物,而ToRNeDO则实现相反的效果,它可以发现将两种蛋白质结合在一起的化合物,一种是目标的E3泛素连接酶和一个感兴趣的新基质,以实现靶向蛋白质降解。
这两种技术都依赖于强大的反筛概念。SyntheX的联合创始人兼首席执行官Maria Soloveychik博士说:“从这个意义上说,反筛类似于NOR逻辑门的工作原理。”“反筛或双反报告电路都无法产生足够严格的反筛程度,以极低的错误识别率筛选数十亿个排列。我们筛选来自高多样性库(>1010)的化合物,很低的脱靶率。”
由于PPI的交界面往往是大而平坦的表面,因此库专注于具有多样化可变区域的肽和迷你蛋白质脚手架,以找到可以正交阻止交互的命中,或发现可能异构干扰PPI的新表面或口袋。​
细胞选择平台绕过了许多体外瓶颈,不需要相关目标的结构信息,也没有必要将结构限制在那些可以重组生产和高度纯化的结构上。SyntheX识别了针对相关蛋白质的分子,这些蛋白质在细胞内环境和生理条件下表达。
这对TORneDO特别有用,在那里,工程和编码系统的组合使人类基因组中的600多个E3连接酶得以使用。通过筛选小分子库,TORneDO可以为具有所需E3连接酶的降解分子识别功能性分子胶。
疫苗和药物输送的细菌平台

 

CHAIN Biotechnology创始人兼首席执行官Edward Green博士说:“我们设计的梭状芽孢杆菌辅助药物开发(CADD)平台提供了从疫苗到免疫疗法的多功能性和广泛的临床适用性。”
CHAIN Biotech生产孢子,这些孢子经过精心设计来释放疫苗和药物。形成孢子的厌氧宿主非常适合在药丸或胶囊中包埋口服。这些孢子可以在胃和上消化道的高酸性和蛋白质水解条件下生存,当孢子到达下消化道时,它们会出芽以达到预防或治疗效果。如,可能会释放影响肠道微生物群和粘膜并激活免疫系统的药物。
CHAIN Biotech设计的细菌菌株在安全方面有着悠久的历史。该菌株在结肠中自然产生丁酸盐,这是一种有益的短链脂肪酸,有利于健康的肠道微生物群的生长。
细菌细胞不会永久定殖。停止摄入孢子后,细菌和分泌疗法会从结肠中出。管理孢子摄入的数量和频率控制剂量。基于孢子的生物疗法易于制造,高度稳定,不需要冷链物流来全球分销。
Green详细介绍道:“对于疫苗,我们针对肠道粘膜中的免疫细胞设计了特定的抗原肽,具有刺激粘膜和全身免疫的潜力,大多数注射疫苗不会诱发这些免疫。”
CHAIN Biotech一直专注于治疗或免疫传染病的口服疫苗。该公司有关于人类乳头瘤病毒(HPV)、人类轮状病毒(HRV)和SARS-CoV-2的临床前项目。CHAIN Biotech还开发了一种基于分泌一种名为β-羟丁酸酯的抗炎代谢物来治疗溃疡性结肠炎的治疗候选药物。

 

一种新的RNA报告系统
Circularis Biotechnology开发了一个发现、增强和验证启动子的系统。该系统的核心是结构化和自循环的RNA报告分子,不需要细胞辅助因子即可运行,它可以在任何类型的细胞中工作。
下一代测序用于跟踪条形码RNA在大规模平行报告分析中的表达,以同时检查数百万到数亿启动子或启动子变体。为了利用广泛的基因组序列,使用人类、非人类灵长类动物和老鼠序列的组合来识别启动子。
Circularis Biotechnology创始人兼CSO博士Paul Feldstein说:“我们使用GENCODE等数据库组合输入用于生物信息测试的启动子库,以确定转录起始位点周围的序列。”“我们使用GTEx来查找显示组织或细胞类型特异性表达的基因。”
为了识别增强子区域,建立了一个包含基因组DNA片段的库,这些片段克隆了核心启动子的上游和条形码报告分子的下游。该库通过细胞运行,读出RNA条形码,基因组片段与细胞类型特定表达式的增强子库成员相关联。
Feldstein指出:“由于对模式生物(如老鼠和老鼠)的依赖,试验具有挑战性。”“当放入人类或非人类灵长类动物细胞时,这些启动子序列不一定表现出相同的组织和细胞类型特异性。”
这需要尽可能多地使用人类细胞系和代表广泛组织类型的细胞系来识别具有最大特异性的启动子。诱导的多能干细胞或有机体模型是有价值的替代品。在最佳情况下,平行开发轨道使用鼠启动子,使用人类或非人类灵长类启动子进行临床试验。
使用RNA测序和定量PCR来确定启动子结构是否具有脱靶效应。如果适合模型生物体,GFP可以更好地检查更广泛的组织类型。
Feldstein说:“我们继续寻找更好的终止子,以更好地将插入基因的表达与基因组中的基因表达隔离开来。”Circularis技术可以应用于各种基因表达成分,包括对UTR、终止子、microRNA和诱导系统表达的影响。

 

基于微流体的蛋白质工程平台
通过应用正确的技术,可以显著加强将合理设计与基于进化的方法相结合的蛋白质工程策略。默克公司蛋白质工程总监Grant Murphy博士说:“我们利用Rosetta和Bio-Prodict的工具来识别丰富我们变体库的有益突变。
由于Murphy的团队有一系列表达系统——如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、CHO和无细胞表达系统——它可以设计具有不同复杂程度和翻译后修饰的蛋白质。无细胞表达系统具有高度可伸缩性(μL到L),可以以合理的成本生产复杂的蛋白质。
对于蛋白质功能,高通量、数据丰富的方法从稳定性、溶解度和活性等多个维度来探索蛋白质功能。Murphy指出:“我们利用各种仪器来全面了解蛋白质,以及工程如何沿着几个维度改善蛋白质。”
基于液滴的微流体学已应用于使用细胞基或无细胞系统的蛋白质工程;然而,对液滴进行分类需要使用荧光取代基团。Murphy断言:“使用大规模激活液滴排序技术,我们开发了一个超高通量、基于微流体的蛋白质工程平台,该平台直接测量所需的功能,而不必使用荧光取代基团。”“这个平台极大地扩大了我们可以处理的工程项目的范围。”
蛋白质工程和设计的进步使我们能够在优化蛋白质结构方面取得巨大进展。我们可以专门为稳定性和溶解度进行设计,我们可以取代免疫源性热点。然而,我们对结构和动力学如何影响功能(催化和结合)的理解仍然非常有限。
如果有良好的结构信息,我们可以使用计算设计来改进结合。在缺乏良好结构的情况下,基于进化的方法依赖于正筛和负筛。
Murphy总结道:“蛋白质设计、结构预测和相关蛋白质运动的结构生物学方法的最新进展应该使我们能够更好地了解结构和动力学对功能的微妙作用。”

 

(杨思琪 摘译)


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