微生物遗传与工程生物学摘自https://doi.org/10.1371/journal.pone.0291520 

       致病性大肠杆菌和肠道沙门氏菌能够引起严重疾病,造成严重的公共卫生威胁,而且细菌中抗生素耐药性的出现和传播使感染控制复杂化。因此目前我们迫切需要针对性地根除或减少这些肠道病原体及其含有的抗生素耐药型基因的方法。而CRISPR-Cas系统是原核生物的保护性屏障,在适应性免疫中起识别和破坏入侵的质粒和病毒的作用,当CRISPR-Cas系统识别并切割目的双链后就会导致目标细胞的死亡,而当针对质粒DNA时,质粒便会被消除,因此CRISPR-Cas9系统是一种潜在的有吸引力的治疗细菌感染的替代方案。

近日,来自美国爱达荷大学的Scott A. Minnich实验室PLoS One发表的一项名为《Engineering conjugative CRISPR-Cas9 systems for the targeted control of enteric pathogens and antibiotic resistance》的研究即利用和设计自传递的接合质粒来传递CRISPR-Cas9抗菌剂,该抗菌剂可以专门针对肠出血性和肠致病性大肠杆菌、肠链球菌和blaCMY-2抗生素抗性质粒,达到杀死目标病菌并去除抗生素型质粒的效果。

该组主要做了以下实验:

首先他们通过基因筛选,分别选择eae和ssaN基因作为靶向肠致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌的目标基因,该两种基因分别为两种致病性菌编码毒性物质的特异性基因,然后根据目标基因合成相应的gRNA。接着利用blaCMY-2质粒的保守靶向序列合成相应的gRNA,将具有较高接合偶联性的菌株pBP136Kan通过CRISPR编辑改造为pTF16和pTF18,这两个工程菌株就分别形成了可以靶向eae和ssaN或eae和blaCMY-2的CRISPR系统。

接着,该组将转入pRK24-CRISPR的大肠杆菌K12作为供体,EHEC的两种等基因突变体eae+/Δtir (NalR)、Δeae/tir+KanR)作为受体,其中NalREHEC有eae基因对应的靶点,即实验组,KanR代表没有靶点,即对照组,在6h的交配后,将近96%的对照组接入了pRK24-CRISPR系统,实验组的细菌致死率达99.9%,这些数据说明pRK24-CRISPR-Cas9具有高效的质粒转移率,质粒存在较为稳定,而且接合传递的pRK24- CRISPR-Cas9也具有特异性靶向杀伤能力。

然后,评估工程菌株pTF16对多种血清型EPEC、EHEC和肠道沙门氏菌的CRISPR-Cas9抗菌能力,该组分别以含有pTF16的大肠杆菌作为供体,将大肠杆菌K12 (RifR)、EPEC (NalR)、EHEC (NalR)和鼠伤寒菌作为受体,结果显示,CRISPR-Cas9的靶向杀伤能力依旧很高(细胞死亡率从91%-96%),对照组大肠杆菌K12几乎没有死亡,可见pTF16对多种血清型EPEC、EHEC和肠道沙门氏菌的CRISPR-Cas9抗菌能力广泛。然后通过pCP20去除pTF16中的CmR标记得到pTF16s作为供体,EPEC(NalR)和EHEC (RifR)作为受体,与pBP136kan作为供体,相同两种受体菌作为对照,结果发现实验组菌落减少较多,而对照组菌落数量几乎没有变化,由此可以看出去除了CmR而没有选择标记基因的pTF16s与pTF16在结合和杀伤效率上没有差异。

接着,为了获得CRISPR-Cas9系统靶向携带ARG质粒的能力,该组设计了含有靶向blaCMY-2的pTF18工程菌。供体菌为pTF18与受体大肠杆菌 (NalR, AmpR, CmR)配对过夜,作为对照,上述受体细胞与pTF16杂交过夜,结果显示,由于pTF16缺乏导向blaCMY-2的gRNA,对照组对抗生素氨苄不敏感,与之相对的,实验组细菌对于氨苄非常敏感。

为了验证该抗菌剂的效果,该组使用接入产肠毒素大肠杆菌的小鼠新生儿作为实验模型。三组小鼠口服EPEC (NalR),感染病菌后,三组小鼠分别用pBP136kan (RifR, KanR)、pTF16 (RifR, CmR)和PBS来治疗,之后,检测小鼠肠道菌落组成,结果显示,第二组小鼠的致病菌数量明显少于1、3组,即通过接合质粒递送的CRISPR-Cas9抗菌药物减少了小鼠肠道中肠毒素大肠杆菌的治病负担。

该项研究的结果表明了在肠道微生物群中建立结合的CRISPR-Cas9工程菌抗菌剂可以提供对肠道的保护,杀灭致病性细菌,并在不破坏正常微生物群的情况下降低细菌抗生素耐药性。这是目前首次报道的可以通过工程化的自传播接合质粒递送CRISPR-Cas9抗菌剂来控制靶向肠道病原体并阻断耐药性的传播,未来这种方法可以用于治疗应用,或用于从人类和农场动物的微生物群中去除肠道病原体和抗生素耐药性。

 

 

(梁尹摘译)


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