湖州中科工业生物技术中心
微生物遗传与工程生物学摘译自： https://doi.org/10.1002/anie.202315093
CRISPR/Cas9 系统是一种功能强大的基因组编辑工具，可精确编辑基因组序列。Cas9蛋白可在3碱基原位相邻基序（protospacer-adjacent motif，PAM）和单链向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）的招募和引导下识别特定的目标双链DNA。
在基因治疗领域，已开发出三种CRISPR/Cas9 系统递送模式，包括 sgRNA/Cas9编码质粒、sgRNA /Cas9-编码mRNA 和 sgRNA/Cas9 复合物。
其中sgRNA/Cas9 复合物无需在细胞内进行转录或翻译。但在递送复合物时，Cas9 蛋白容易失活。
近日，来自中国科学院国家纳米科学中心的丁宝全团队在《Angewandte Chemie》杂志上发表研究“A DNA Origami-Based Gene Editing System for Efficient Gene Therapy in Vivo”以DNA折纸这一概念为出发点，构建了在体外能以一锅法进行包装、在体内能自发靶向和释放Cas9复合物的基于DNA的Cas9递送系统。
细节如下：
研究在保证选用的Cas9复合体功能完整的情况下设计了DNA折纸所需的单链DNA，随后通过95℃缓慢退火至20℃获得了二维结构的DNA折纸材料，去除多余的辅助链后，将纯化的 DNA 折纸材料与多条功能链（包括富含 PAM 的 单链DNA、DNA适体（用于靶向特定器官） 和 HA-ssDNA（用于在细胞内释放Cas9复合物））混合，形成表面富含 PAM 区域的 DNA 折纸材料（DNA origami template with the PAM-rich region on its surface，DOPAM）通过 PAM 引导的组装和预先设计的 DNA/RNA 杂交（cargo-loaded DNA origami ，DOPAMRC）将 sgRNAL/Cas9 募集并加载到 DOPAM 上。载货的 DOPAMRC 接着被带有二硫键的锁定链（locking strands with a disulfide bond ，L-DOPAMRC；该锁定链能被谷胱甘肽水解二硫键，进而释放复合物）卷起。（注：该过程详见文献方法部分）
sgRNAL的由来
随后研究在MCF7肿瘤细胞中测试了DNA纳米递送系统搭载Cas9复合物后的编辑效率，以MCF7肿瘤细胞中的绿色荧光蛋白为靶标，发现L- DOPAMREC 减少了约 75% 对 DOPAMREC 减少了约 50%（区别在于是否添加锁定链）。以PLK1基因为靶标则能显著下调PLK1蛋白的表达水平。
以靶向PLK1基因为例的编辑效果差异图，RpC组为无包裹的Cas9/sgRNA复合物
细胞杀伤效率测试结果显示在L-DOPAMRPC组中，超过75%的细胞能被PI染色（意味着细胞死亡）。流式细胞术对细胞凋亡进行了定量分析，发现经 L-DOPAMRPC（靶向肿瘤相关基因PLK1） 处理的细胞凋亡率约为 70%。在 L-DOPAMREC（靶向 增强型绿色荧光蛋白EGFP基因）组中没有观察到明显的肿瘤细胞增殖抑制，这表明基于 DNA 折纸的递送系统脱靶率较低。以肿瘤相关基因（PLK1）为靶点的DNA折纸基因编辑系统能有效地上调肿瘤细胞的凋亡，下调肿瘤细胞的增殖。
对裸鼠肿瘤移植模型进行肿瘤抑制实验发现L-DOPAMRPC能显著的抑制肿瘤的生长。
综上，研究提出的人工DNA纳米结构（DNA折纸技术）能有效地提升Cas9复合物的靶向递送效率，将为肿瘤治疗和基因组编辑带来便利。
（徐毅诚摘译）
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