从化学合成支原体全基因组开始,到人工构建单染色体酵母,人类对生命可能的探索从未停止。
细菌通常被认为只包含一个圆形的染色体。然而随着研究的深入,很多蓝细菌或古生菌被发现是多倍体。

近日,来自中科院天津工业生物技术研究所的张学礼、毕昌浩课题组在《Advanced Science》杂志上发表研究“Artificial Diploid Escherichia coli by a CRISPR Chromosome-Doubling Technique”基于CRISPR技术开发了能稳定遗传的二倍体大肠杆菌,该大肠杆菌或将推动相关基础研究并为工业开发创造新的可能。

二倍体大肠杆菌的构建过程如图所示,首先将被氯霉素抗性基因一分为二的青霉素抗性基因通过同源重组整合至野生型大肠杆菌基因组上ddpX和dosP基因之间的序列上,随后引导CRISPR-Cas9切割氯霉素抗性基因两端,被一分为二的氨苄青霉素基因由此在大肠杆菌体内自发重组为完整的氨苄青霉素抗性基因。伴随DNA复制和抗生素压力产生稳定的二倍体大肠杆菌。(该过程对条件要求较高,Cas9系统的诱导强度、氨苄补充的时机、接种的比例都会直接影响后续结果)
在抗性平板上筛选成功以后,研究使用稀释涂板和流式细胞术对所得培养物中的单菌进行分离,最后通过三对引物PCR结果的差异验证筛选所得转化子的基因型。
考虑到筛选结果可能是多倍体,研究设计了针对氨苄青霉素和五个内源基因的引物通过基于荧光定量PCR的相对定量方法、荧光原位杂交和全基因组测序对基因拷贝数进行了基于上述方法的验证,结果发现所得的大肠杆菌为二倍体。
为了验证二倍体大肠杆菌的染色体稳定性,研究以8个转化子为一组设置了无抗传代组和有抗传代组,传了一百多代以后,发现无抗组的8个转化子的子代中只有一个保持了二倍体结构,而有抗组所有子代均保持了二倍体结构。
生长曲线分析发现二倍体大肠杆菌在无抗条件下倍增时间大约为77.66分钟,有抗条件下倍增时间为80.3分钟,相对于出发菌株,二倍体菌株的倍增时间要长一倍。
电镜分析显示二倍体菌株的细胞体积显著大于单倍体菌株。全转录组测序发现参与细胞分裂的15个基因除ftsZ基因外,转录水平均显著降低,参与脂多糖代谢的17个基因表达显著降低,参与肽聚糖代谢的9个基因表达显著降低。说明二倍体状态会影响增殖信号通路,增加代时并延迟了子细胞的分离过程。
最后研究对二倍体大肠杆菌进行了紫外线耐受测试,发现其存活率相比单倍体大肠杆菌高了约40倍。
综上,研究提出了一种通用的、基于CRISPR-cas9的基因组编辑技术和抗生素筛选构的微生物染色体集倍增技术,并基于该技术构建了能基于抗生素压力稳定增殖二倍体大肠杆菌。小编认为以这一研究成果为出发点的相关研究或将有力的推动科学界对多倍体的认识,同时为工业生产带来新的可能。
​(徐毅诚 摘译)


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