合成生物催化剂摘译自

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05157-3 

https://www.researchsquare.com/article/rs-2061869/v1

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.28040 

 

 

单萜吲哚生物碱是一类结构多样的天然产物,但成药仅有三种是化疗药物伊立替康、长春碱和长春新碱,原因是天然提取的低产无法实现批量生产,以及多个立体活性中心使得化学合成路线非常复杂。以长春碱为例,500公斤干燥的长春花叶产1克长春碱,直接提取无法批量生产,目前的生产路线是从长春花提取其前体文多灵和长春质碱,再化学合成。这种半合成的药物供应会受到当年植物产量的影响,长春碱和长春新碱被FDA列为2019-2020 年短缺药物,使得寻求更稳定的供应更加迫切,如通过合成生物学让微生物发酵产生,一如已经商业化的用酵母合成抗疟疾药物前体青蒿酸的成功案例。

2018年前长春碱生物合成途径尚未完全解析清楚,不少团队将已解析的酶导入酵母合成不同的前体,如2015年英国约翰英纳斯中心O'Connor团队从头合成异胡豆苷;2015年加拿大布鲁克大学团队从它波宁合成文多灵和2021年法国图尔大学提升了产量;20221月浙大连佳长从头合成阿马碱 。长春碱的生物合成最后几个基因于2018年由前述O'Connor团队解析清楚后发表在Science期刊使得从头合成成为可能。

20229月共有2篇论文报道了在酿酒酵母里成功合成文多灵和长春质碱。其一由美国加州大学伯克利分校的Keasling教授团队发表在自然杂志上的题为A microbial supply chain for production of the anti-cancer drug vinblastine,正是首个报道用酵母合成青蒿酸的团队;其二是由浙江大学连佳长课题组在Research Square发表题为De novo Biosynthesis of Vindoline and Catharanthine in Saccharomyces cerevisiae的预印版,两篇论文的产量都在100 μg1 mg级别。

单萜吲哚生物碱由莽草酸途径(又称为吲哚途径) 和类甲羟戊酸途径(又称类萜途径)分别形成两个前体牻牛儿基二磷酸盐(geranyl pyrophosphateGPP)和色氨酸合成。两篇论文都将整个生物合成途径划分为三个功能模块(图1),共计至少48步酶,其中至少32步来自植物,分别位于植物的5个区室中:

1. 从葡萄糖到GPP和色氨酸,再到异胡豆苷或异胡豆苷苷元,这步是超过3000个单萜吲哚生物碱的通用前体;

2. 从异胡豆苷或其苷元到长春质碱或它波宁;

3.从它波宁到文多灵。

如前所述,13模块的酵母异源合成已经被报道过。两篇论文主要的创新点是打通了123全过程,且优化了产量。

Keasling实验室对于模块1的优化集中在对4P450酶以及限速酶疏通。先将P450酶融合酵母荧光蛋白观察其细胞器定位是否正确以及荧光强度,然后用靶向蛋白质谱鉴定到表达弱的几个酶,再通过中间代谢产物饲喂锁定限速酶是异胡豆苷合酶(strictosidine synthaseSTR)【是将色氨酸下游色胺和GPP下游裂环马钱子苷合二为一的关键酶】,上游环烯醚萜合酶(iridoid synthaseISY)以及 8-羟香叶醇氧化还原酶(8-hydroxygeraniol oxidoreductase8HGOGOR)。利用同系酶的筛选疏通以上三步。为了避免酿酒酵母受Crabtree效应的表达调控,文章最后用葡萄糖依赖启动子下调类萜合成支路酶,用组成型启动子替换类萜合成关键酶等优化使得葡萄糖到异胡豆苷产量从优化前的μg级别到了mg级别。然后论文表达关键酶异胡豆苷-O-β-D-葡萄糖苷酶(strictosidine-O-β-D-glucosidase, SGD)从异胡豆苷合成异胡豆苷苷元,由于异胡豆苷苷元不稳定不易检测,再加一步合成四氢鸭脚木碱作为报告产物,全长或截短长春花来源的SGD不产四氢鸭脚木碱,筛选46个同系酶,找到一个产量最高的,但和长春花来源的定位不同,然后将该酶拆成4个功能域和长春花来源的进行排列组合,找到了活性高且定位正确的杂合酶。模块2和模块3先单独组装,用异胡豆苷和色胺饲喂确认产物。尝试将长春碱合成最后几个酶也一并导入但没有实现从文多灵和长春质碱合成长春碱。123模块合并之后,再进行了限速酶的基因剂量优化,在以葡萄糖为碳源,半乳糖为诱导剂,3xSC培养基中添加3 mM色氨酸,补料发酵11天产长春碱和文多林91.4 μg/L 13.2 μg/L。最后尝试将发酵产物化学合成长春碱,但直接从发酵液提取失败,使用薄层色谱法和制备型高效液相色谱法提取后化学合成检测到 23.9 μg/L长春碱。

浙大连佳长和清华李春课题组今年初发表了从头合成一种单萜吲哚生物碱——阿马碱,由长春碱模块1产生的异胡豆苷苷元一步合成。论文首先从酿酒酵母约6000个基因中选出近20个必须基因间位置作为整合位置并鉴定其整合效率和工程菌的传代稳定性,以防止后续工程菌因外源序列同源重组导致基因组删除。然后,论文将合成阿马碱的基因放在半乳糖诱导启动子后整合到基因组,和Keasling课题组类似的,用葡萄糖依赖启动子下调类萜合成支路酶获得阿马碱产量,用SGD突变体替换野生型将产量提升约10倍到近50μg/L;进一步提升NADPH辅因子供应,增强GPP供应,以及关键酶表达将产量提升到mg级别;提升S-腺苷甲硫氨酸供应,结合类萜支路酶敲除,P450酶多拷贝化和启动子激活系统再提升产量数倍;最后优化氮源中的蛋白胨和培养温度产量达到61.4 mg/L。本论文在阿马碱生产菌里面敲除从异胡豆苷苷元合成阿马碱的酶没有检测到异胡豆苷积累说明SGD足够。进一步整合模块2基因打通长春质碱和它波宁合成,再逐个表达每个酶确认限速步骤并进一步上调其基因剂量,合成长春质碱的最高产量可达527.1 μg/L。进一步整合模块3基因打通文多灵合成,优化基因剂量,最后的工程菌株摇瓶中用YP培养基半乳糖诱导发酵48小时可产149.3 μg/L文多灵

 

1酿酒酵母从头合成文多灵和长春质碱的代谢途径图整个生物合成途径被划分为三个功能模块,SAG模块(蓝色部分):从碳源到异胡豆苷苷元(strictosidine aglyconeCAT/TAB模块(棕色部分):从异胡豆苷苷元到长春质碱(Catharanthine)或它波宁 (Tabersonine);VIN模块(红色部分):从它波宁到文多灵(Vindoline)。

蒋宇 摘译


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