合成生物催化剂工程:https://www.nature.com/articles/s41467-022-32743-w 

双链DNA断裂(DNA double-strand breaks DSB)是严重的基因毒性损伤,需要正确修复以防止突变、基因组信息丢失或破坏性染色体重排。此外,Cas9或相关核酸内切酶形成的位点特异性DSB也是基于CRISPR基因组编辑的核心。

哺乳动物配备了多种修复途径来修复DSB在大多数细胞中,主要的DSB修复途径是典型的非同源末端连接(canonical Non-Homologous End-Joiningc-NHEJ同源重组(Homologous RecombinationHR)是第二DSB修复途径。相比于c-NHEJ,通过HR可以依赖于同源臂实现大片段插入这扩大了编辑的可能性然而,通过HR途径进行基因编辑的方法受到频率低的阻碍,即HRc-NHEJ途径会竞争目前已开发许多提高HRc-NHEJ比率的策略,但是c-NHEJ出奇的稳定,即使提高了HRc-NHEJ仍然是主要的修复途径。

除了上述两种方法,DSB还可以通过替代末端连接alternative End-Joininga-EJ或单链退火(single strand annealingSSA)进行修复。这些机制上不同的DSB修复途径并不独立发挥作用,而是在一个受到严格监管的网络中发挥作用,以最佳地保持基因组的完整性。DSB 修复网络的放松管制会降低基因组稳定性,并可能产生严重的致病后果,最显的是癌症发展。

近期,麻省理工大学Michael B. Yaffe实验室和莱顿大学Haico van Attikum实验室在nature communications发文:Multi-pathway DNA-repair reporters reveal competition between end-joining, single-strand annealing and homologous recombination at Cas9-induced DNA double-strand breaks。作者揭示了Cas9诱导的DNA双链断裂处末端连接、单链退火和同源重组之间的竞争。

为了量化每个细胞修复途径的占比,作者构建并验证了三个名为DSB的基于Cas9荧光报告基因,每个单独途径对单个位点特异性 DSB 的修复会导致荧光蛋白的独特、途径特异性表达模式。在多细胞群体中,这种报告系统可用于使用流式细胞仪作为读数同时量化多个DSB修复途径的修复频率。DSB谱版本1可以揭示单个细胞群内 c-NHEJHR DSB修复途径之间的相互依赖性和串扰;DSB谱版本2诱变末端连接诱变c-NHEJ或a-EJHR 的准确报告器;DSB版本3能够区分通过HR、诱变末端连接或SSA进行的DSB修复

DSB版本1为例,在产生DSB后,可通过无错误的c-NHEJ连接DSB恢复蓝色荧光蛋白表达,或者通过HR进行修复将导致绿色荧光蛋白的基因转换和表达,因此可将无错误的c-NHEJHR诱变修复途径例如诱变c-NHEJa-EJ区分出来,其中诱变修复途径不会导致BFPGFP。通过荧光检测,大约30%的细胞是BFP,而约1.5%的细胞是GFP表明与无错误的c-NHEJ相比,少数DSBHR修复。

随后,通过抑制c-NHEJ因子DNA-PKcs,发现HR介导修复的细胞占比增加,证明细胞通过增加HR以补偿c-NHEJ损失,但也会显着增加诱变SSASSA介导的DSB修复发生在内源基因组位点,由Alu元件或同源基因区域驱动。

SSAHR两条通路竞争相同的底物时,长距离末端切除因子DNA2Exo1会促进SSA并降低HR,而敲除Exo1DNA2后观察到SSA的减少,这些因子的失去反而促进了HR

总的来说,这基于Cas9三个版本DSB报告器有助于全面分析修复途径串扰和DSB修复结果。

 

DSB-Spectrum_V1

 

 

DSB-Spectrum_V2

 

 

DSB-Spectrum_V3

 

 

 

(王利钰 摘译)


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