合成生物催化剂工程,摘译自:
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01410-2

尽管已有很多PAM兼容的SpCas9变体,但一些位点特别是富含嘧啶的PAM序列仍然无法被其识别。其他Cas同源物在PAM兼容性方面差异很大,但在哺乳动物细胞中却不那么活跃,因此改造非SpCas9并不常见。Nme2Cas9是SpCas9的同源物,野生型识别N4CC PAM,因此可以作为嘧啶PAM改造的起点。此外,Nme2Cas9尺寸臂SpCas9小,递送更有优势,且作为核酸酶和碱基编辑器都在哺乳动物细胞中表现出强大的活性。

近日,博德研究所的 David R.Liu 等在Nature Biotechnology发表题为“High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs”的论文,使用噬菌体辅助非连续进化和高通了eVOLVER驱动噬菌体辅助连续进化平台定向进化Nme2Cas9,使PAM范围从N4CC扩展至N4YN。首先,作者将dNme2Cas9与TadA8e融合,在gIII中插入一段分裂的内含肽,分裂的N和C端中间用含有PAM和两个终止密码子的linker连接,只有酱终止密码子修正,噬菌体才能大量繁殖。用这个方法非连续和连续进化,结合碱基编辑器PAM分析,进化出了4个Nme2Cas9变体:eNme2-C、eNme2-C.NR、eNme2-T.1和eNme2-T.2,在单个嘧啶核苷酸PAM上编辑效率更高且脱靶率低。

该研究拓展了PAM,改造方法具有通用性,原则上也可以用于优化其他Cas蛋白。

(杨思琪 摘译)


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