合成生物催化剂摘译自https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-022-01896-0

枯草芽胞杆菌是重要的工业微生物,被广泛用于药品、化妆品等的生产,并且是生产各种工业酶的理想表达宿主。枯草芽胞杆菌中已经开发了适用于迭代基因组编辑的双质粒CRISPR-Cas9系统,但双质粒系统的编辑周期长。

近日,来自华中农业大学的胡咏梅等人在《Microbial Cell Factories》期刊上发表文章“Development and application of a rapid all-in-one plasmid CRISPR-Cas9 system for iterative genome editing in Bacillus subtilis”,构建了一个“多合一”的CRISPR/Cas9单质粒系统,缩短了枯草一轮编辑周期。该系统能够实现100%的单基因缺失和点突变效率以及96%的基因插入效率。由于所有原件均整合在一个质粒载体上(11kb),载体太大导致转化效率低,研究人员将质粒消化成片段后使用分子凝结剂PEG4000辅助连接质粒片段后转化入枯草,转化效率相对于直接转化提升了2~3个数量级。研究在质粒上设计了Pspo0A严格控制下的自靶向sgRNA用于丢质粒,效率可达90%。作为概念验证,研究使用该系统连续敲除两个细胞外蛋白酶基因eprbpr,仅用了2.5天就完成了一轮基因组编辑。

综上,研究构建了一个枯草芽胞杆菌CRISPR/Cas9“多合一”单质粒系统,结合自靶向sgRNA进行迭代编辑,一轮编辑周期仅2.5天,是报道的最快的迭代编辑系统,加速了枯草芽胞杆菌的工程细胞构建。

 

图:枯草芽孢杆菌基因组迭代编辑流程

(周晓杰 摘译)

 

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