枯草芽胞杆菌被广泛用于工业上生产重组蛋白，但是外源蛋白的表达往往收到严重限制。尽管已经有许多异源蛋白能够在枯草芽胞杆菌中表达，但是在外源蛋白产品的分泌效率上，特别是那些对宿主细胞有害的蛋白质产品，仍有一些挑战尚未解决。

近日，来自江南大学的刘龙等人在《Bioresource Technology》期刊上发表文章“A genetic toolkit for efficient production of secretory protein in Bacillus subtilis”，构建了一个提高枯草芽孢杆菌外源蛋白分泌效率的遗传工具。首先，研究对枯草芽胞杆菌Bs168进行了重构，过表达comK基因以使其能够诱导超级感受态细胞，提升其转化效率；对trpC2和gudB进行回复突变，使其能够在基本培养基（不需要添加色氨酸）中生长，并且能够有效利用谷氨酸族氨基酸；使用CRISPR/Cpf1敲除8种非必须的细胞外蛋白酶AprE、NprE、Epr、Mpr、Bpr、NprB、Vpr和WprA以减少对外源分泌蛋白的降解，对不同菌株的胞外蛋白产量和胞外蛋白酶活性进行表征后，选择敲除aprE、nprE、bpr、mpr和nprB的菌株G600进行进一步研究。

为了防止在构建穿梭质粒过程中由于细胞毒性导致的点突变，研究筛选了人工构建的启动子文库和114个枯草芽胞杆菌内源性组成型启动子以获得在大肠杆菌中不表达，但在枯草中高表达的启动子，最终确定了内源性组成型启动子Phag和PspovG作为蛋白表达启动子。进一步的，研究设计了一种带有信号肽的核糖体结合位点(RBS)系统组合优化方法(systemic combinatorial optimization of ribosome binding site equipped with signal peptide, SCORES)来优化外源蛋白的分泌和翻译。最后，研究使用重构的Bs168和优化的启动子、信号肽表达了通过降解核酸导致细胞死亡的粘质沙雷氏菌非特异性内切酶(Serratia marcescens nonspecific endonuclease,SMNE)，其摇瓶酶活达7.5 × 10⁶ U/L，是对照RBS和信号肽组合(RS₀)的7.5倍。

综上，研究通过枯草芽胞杆菌宿主重构、启动子和信号肽优化提升了分泌蛋白的表达。该研究不仅拓展了枯草芽胞杆菌的合成生物学工具箱，而且为构建原核蛋白表达系统提供了策略。

（周晓杰 摘译）