合成生物催化剂工程:

https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-022-01900-7 

 

 

S-腺苷-L-蛋氨酸S-adenosyl-L-methionineSAM)是一种重要的生物活性分子,参与多种生物过程。目前已筛选出多种SAM生产水平较高、被用作底盘的微生物,酿酒酵母由于其安全性,通常被用作生产SAM的微生物细胞工厂,然而,酿酒酵母是Crabtree阳性酵母,SAM生产受到葡萄糖抑制的负面影响,当葡萄糖含量过高时,即使在氧气存在的情况下,也会进行发酵代谢,由于这种氧化发酵,酿酒酵母在葡萄糖水平过高时会产生大量乙醇,这会导致细胞生长和SAM生产所需的碳代谢通量、辅因子和能量的损失。为了应对这种情况,有报道通过葡萄糖补料策略减少乙醇产量,从而使菌株产SAM提升23%。酿酒酵母的乙醇合成途径主要涉及丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶,有研究表明通过删除丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶中任一基因,都可以阻断乙醇产生,但是会导致严中的生理缺陷。如何消除酿酒酵母中的Crabtree效应并将碳通量定向到其他目标产物上是一大挑战。

在酿酒酵母中,SNF1复合物是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,由SNF1基因编码的催化亚基Snf1、三个亚基之一(Gal83Sip1  Sip2)和调节亚基Snf4组成,并且参与许多细胞活动的全局调节,包括葡萄糖抑制、应激反应和增殖。当葡萄糖以高浓度存在时,SNF1复合物通过1型蛋白磷酸酶复合物Glc7/Reg1(由GLC7REG1基因编码)对Snf1亚基的去磷酸化而失活,其中REG1蛋白磷酸酶PP1调节亚基编码基因;当激活时,SNF1复合物磷酸化和失活葡萄糖诱导的转录抑制因子Mig1,从而阻止Mig1与编码转录激活因子Sip4Cat8的基因的上游调节元件结合,从而激活葡萄糖抑制基因的表达。有报道称,SNF1基因的过表达增强了对各种环境胁迫的反应,以及SNF4的过表达和GLC7REG1的缺失通过改善酵母中的葡萄糖抑制,有效增强麦芽糖代谢和发酵能力。

在酵母中,2型乙醇脱氢酶ADH26型醛脱氢酶ALD61型乙酰辅酶A合酶ACS1协同催化乙醇转化为乙酰辅酶AADH2ALD6ACS1的表达在没有活性SNF1复合物的情况下在葡萄糖水平过高的条件下受到抑制,而在葡萄糖存在的情况下,活性 Glc7/Reg1 复合物使 SNF1 复合物保持在非活性状态。简而言之,SNF1 复合物对结构基因的去抑制起关键作用,结构基因在高葡萄糖浓度的存在下被抑制。

近期,中国药科大学马菱蔓实验室在Microbial Cell Factories发文:The multiple efects of REG1 deletion and SNF1 overexpression improved the production of S-adenosyl-l-methionine in Saccharomyces cerevisiae。通过删除编码蛋白磷酸酶1的调节亚基的REG1和过表达编码SNF1复合物的催化亚基SNF1 来减轻葡萄糖抑制的策略,用于提高酿酒酵母中SAM的产生。

为了评估REG1SNF1对酵母中SAM产生的影响,构建了缺失REG1/或过表达SNF1的突变体,并在不同葡萄糖浓度(5%10%葡萄糖)的培养基中培养,表明REG1缺失和/SNF1过表达的多重效应在提高酵母中SAM产量方面表现出巨大的潜力。在5%的葡萄糖下,REG1敲除、SNF1过表达、同时REG1敲除和SNF1过表达的菌株SAM提高了14%18.8%29.7%;在10%的葡萄糖浓度下,分别提高了53.7%55.6%79.6%。通过分析了与葡萄糖转运和糖酵解途径相关的几个基因的相对表达水平,发现REG1缺失和SNF1过表达增强了糖酵解途径并改善了葡萄糖的利用,从而增加了酵母细胞生长和氨基酸生物合成所必需的糖酵解中间体的细胞内水平。

此外,只要培养基中存在葡萄糖,对照组菌株的乙醇脱氢酶II ADH2活性较低,当葡萄糖耗尽时,其活性增加;然而,不论培养基中是否存在葡萄糖,突变体的ADH2活性显著高于对照组,编码乙酰辅酶A合酶IACS1和编码醛脱氢酶的ALD6的表达水平也增强,作者猜测这可能促进发酵液中的乙醇转化为乙酰辅酶A

通过REG1缺失和SNF1过表达,前体氨基酸的生物合成,涉及含硫氨基酸的基因表达也得到了增强,酵母的寿命也与对照组相比有一定的延长。最终,REG1敲除和SNF1过表达的菌株在10 L发酵罐中的SAM产量达到8.28g/L,比亲本菌株高51.6%

总的来说,REG1缺失和SNF1过表达的多重效应提高了酿酒酵母中SAM的产量,为SNF1复合体应用于减轻葡萄糖抑制并将碳流重新定向到酿酒酵母中的非乙醇产物提供了新的见解。

 

(王利钰 摘译)


地址:浙江省湖州市红丰路1366号 湖州市南太湖科技创新中心1-3楼 邮编:313000
电话:0572-2165708 传真:0572-2165708 Email:info@cibt.ac.cn

Powered by PageAdmin CMS