合成生物催化剂工程

https://www.nature.com/articles/s41467-022-32079-5 

CRISPR-Cas和Ago(Argonaute)蛋白是两种主要的可编程核酸酶,在真核生物和原核生物中都具有防御和调节功能,都使用短核酸引导物来识别。真核生物中,Ago蛋白在RNA干扰中发挥核心作用,通过引导RNA识别RNA靶标;在原核中,大多数具有核酸酶活性的pAgo对DNA引导和DNA靶标具有天然特异性,但是一些研究也发现在体外原核Ago(prokaryotic Argonautes,pAgos)也能结合切割RNA,但是没有发现对RNA靶标有明显偏好性的pAgo。

俄罗斯科学院基因生物学研究所Andrey Kulbachinskiy实验室和宾夕法尼亚州立大学Katsuhiko S. Murakami实验室在nature communications上发文:Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity。在这项研究中,描述了一类新的pAgo,它独特地使用DNA引导来处理RNA靶标。

作者在之前的原核基因组分析中发现了多个pAgo,对其中4个进行分析,分别是来自Pseudooceanicola lipolyticus的PliAgo、来自Runella slithyformis的RslAgo、来自Pedobacter  nyackensis的PnyAgo和来自Hydrobacter penzbergensis的HpeAgo进行表征,在体外测试分析了他们核酸酶活性,发现四种蛋白都使用DNA短链引导,靶向RNA,对向导和靶标的其他组合没有显示出活性,仅PnyAgo在长时间孵育的情况下观察到DNA引导下对DNA的较弱切割。序列比对发现,四种蛋白的PIWI结构域具有典型的DEDD四联体,第一个和第三个残基突变将会突变导致失去靶序列切割能力。这类新发现的pAgo属于一类新的可编程核酸酶,由于使用DNA指导来识别和切割RNA靶标,作者将这组pAgo称为DR pAgos(按照此分类,所有真核Ago属于RR Agos)

通过测试温度、二价阳离子和引导分子结构对切割效率的影响, 发现所有四种pAgo在 30至44°C之间具有最高活性,在高于50°C下失活,在37°C的反应速率与先前报道的其他 pAgo组的切割速率相当。这四种pAgo都对Mg2+Mn2+有活性,但不适用于其他二价阳离子(Ca2+Co2+Cu2+Zn2+)。PliAgo和RslAgo对14-20 nt引导物具有最大活性、PnyAgo和HpeAgo对16-20 nt的引导物有最大活性。

为了阐明新发现的 DR pAgo结合和切割位点选择的机制,作者对pAgo进行结构和生化分析,发现PliAgo具有一种新型的MID口袋,具有以前在任何其他Ago中未发现的RHSY 基序,其通过MID结构域中具有几个带电和极性残基的盐桥识别引导DNA的5'-磷酸,不依赖于二价阳离子和5'端相互作用结合,而已经大多数的pAgo均使用结合在MID口袋中的Mg2+与引导核酸的5’-磷酸相互作用,PliAgo的独特的MID结合口袋使其具有非常规的切割位点偏好性。

通过分析PliAgo与非磷酸化引导DNA的二元复合物的结构,作者还揭示了PliAgo和其他DR pAgo对 5'-磷酸引导DNA的偏好的分子基础,在与5’-非磷酸化的引导DNA的复合物中,引导链5'-末端从MID口袋沿5'方向滑动一个核苷酸,并通过与引导DNA的内部磷酸基团相互作用而固定在新位置,这些变化降低了引导DNA对PliAgo的亲和力,也影响了切割反应的精确度。

最后作者也发现,相对DNA,DR pAgos对RNA靶标识别切割的特异性是由切割位点上的核糖核苷酸残基确定的,DR pAgos可以感知 RNA 靶标特定位置上各种类型修饰的存在。

    这项研究拓宽了我们对原核防御系统的理解,并扩展了可编程核酸酶的谱系,并在RNA 技术中具有潜在用途。 

 

 

(王利钰 摘译)

 



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