https://www.nature.com/articles/s41467-022-32079-5 

CRISPR-Cas和Ago（Argonaute）蛋白是两种主要的可编程核酸酶，在真核生物和原核生物中都具有防御和调节功能，都使用短核酸引导物来识别。真核生物中，Ago蛋白在RNA干扰中发挥核心作用，通过引导RNA识别RNA靶标；在原核中，大多数具有核酸酶活性的pAgo对DNA引导和DNA靶标具有天然特异性，但是一些研究也发现在体外原核Ago（prokaryotic Argonautes，pAgos）也能结合切割RNA，但是没有发现对RNA靶标有明显偏好性的pAgo。

俄罗斯科学院基因生物学研究所Andrey Kulbachinskiy实验室和宾夕法尼亚州立大学Katsuhiko S. Murakami实验室在nature communications上发文：Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity。在这项研究中，描述了一类新的pAgo，它独特地使用DNA引导来处理RNA靶标。

作者在之前的原核基因组分析中发现了多个pAgo，对其中4个进行分析，分别是来自Pseudooceanicola lipolyticus的PliAgo、来自Runella slithyformis的RslAgo、来自Pedobacter  nyackensis的PnyAgo和来自Hydrobacter penzbergensis的HpeAgo进行表征，在体外测试分析了他们核酸酶活性，发现四种蛋白都使用DNA短链引导，靶向RNA，对向导和靶标的其他组合没有显示出活性，仅PnyAgo在长时间孵育的情况下观察到DNA引导下对DNA的较弱切割。序列比对发现，四种蛋白的PIWI结构域具有典型的DEDD四联体，第一个和第三个残基突变将会突变导致失去靶序列切割能力。这类新发现的pAgo属于一类新的可编程核酸酶，由于使用DNA指导来识别和切割RNA靶标，作者将这组pAgo称为DR pAgos（按照此分类，所有真核Ago属于RR Agos）

通过测试温度、二价阳离子和引导分子结构对切割效率的影响, 发现所有四种pAgo在 30至44°C之间具有最高活性，在高于50°C下失活，在37°C的反应速率与先前报道的其他 pAgo组的切割速率相当。这四种pAgo都对Mg²⁺和Mn²⁺有活性，但不适用于其他二价阳离子（Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺）。PliAgo和RslAgo对14-20 nt引导物具有最大活性、PnyAgo和HpeAgo对16-20 nt的引导物有最大活性。

为了阐明新发现的 DR pAgo结合和切割位点选择的机制，作者对pAgo进行结构和生化分析，发现PliAgo具有一种新型的MID口袋，具有以前在任何其他Ago中未发现的RHSY 基序，其通过MID结构域中具有几个带电和极性残基的盐桥识别引导DNA的5'-磷酸，不依赖于二价阳离子和5'端相互作用结合，而已经大多数的pAgo均使用结合在MID口袋中的Mg²⁺与引导核酸的5’-磷酸相互作用，PliAgo的独特的MID结合口袋使其具有非常规的切割位点偏好性。

通过分析PliAgo与非磷酸化引导DNA的二元复合物的结构，作者还揭示了PliAgo和其他DR pAgo对 5'-磷酸引导DNA的偏好的分子基础，在与5’-非磷酸化的引导DNA的复合物中，引导链5'-末端从MID口袋沿5'方向滑动一个核苷酸，并通过与引导DNA的内部磷酸基团相互作用而固定在新位置，这些变化降低了引导DNA对PliAgo的亲和力，也影响了切割反应的精确度。

最后作者也发现，相对DNA，DR pAgos对RNA靶标识别切割的特异性是由切割位点上的核糖核苷酸残基确定的，DR pAgos可以感知 RNA 靶标特定位置上各种类型修饰的存在。

    这项研究拓宽了我们对原核防御系统的理解，并扩展了可编程核酸酶的谱系，并在RNA 技术中具有潜在用途。 

（王利钰 摘译）