合成生物催化剂,摘译自:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35920321/ 

λ-Red重组系统的高效性与操作方便性,在过去二十年中该系统已成为大肠杆菌基因组工程的关键技术。使用PCR获得含有长约50 bp同源臂的线性DNA,即可借助λ-Red系统进行重组。然而,当使用具有短的同源臂时,该系统通常被认为是无法实现较长片段(超过 3-4 kb)的整合。近日,来自俄罗斯国家工业微生物保藏中心的Dmitrii M. Bubnov等人在大肠杆菌中建立了基于反筛标记基因及λ-Red重组系统的外源DNA整合工具,可通过使用较短同源臂实现无痕的、较长片段的DNA22 kb)整合,相关研究发表在近期的Nucleic Acids Research杂志上:Robust counterselection and advanced λRed recombineering enable markerless chromosomal integration of large heterologous constructs

该编辑工具包含两个核心设计,分别是基于cI-hok的反筛系统,及在λRed重组质粒上叠加具有反限制功能(防止核酸内切酶切割未甲基化DNA)的Ocr蛋白。对于cI-hok的反筛系统而言(如图1所示),cI-hok-neo表达事先通过neo标记整合至宿主基因组上,pRedCm质粒提供λRed重组系统,作者使用cI蛋白,该蛋白可抑制PRPL这两个启动子的表达,而PR负责开启cI-hok-neo表达hok基因的表达,PL负责pRedCm质粒上氯霉素抗性基因的表达。因此,当基因整合未成功且cI蛋白未发生突变时,由于氯霉素抗性基因的表达受到cI蛋白的抑制,因此在含有氯霉素的培养基中,大肠杆菌无法生长;当基因整合未成功但cI蛋白发生突变时,由于hok蛋白的表达不再受到cI蛋白的抑制,进而导致菌体死亡;而当基因整合成功时,cI-hok-neo表达被替换,大肠杆菌才可正常生长。而后,作者在这基础之上,又在pRedCm质粒上的λRed系统中叠加具有防止核酸内切酶切割未甲基化DNA的蛋白基因ralardAocr,其中ocr可更好的抑制大肠杆菌内源核酸酶内切酶对外源DNA的切割。借助该工具,作者以55-100%的效率实现了使用较短同源臂下~80 bp、在大肠杆菌基因组上多个位点处进行外源DNA的整合,最大可实现22 kbDNA整合。

综上,本文将cI-hok反筛标记系统与可抑制核酸酶切割未甲基化DNA的系统结合,实现在较短同源臂下、借助λRed系统整合较长外源DNA片段。

(李琦 摘译)

 

1. cI-hok反筛系统的原理


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