生物合成催化剂:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283621006616 

 

CRISPR-Cas适应性免疫系统为细菌和古菌提供了保护而为了应对这种系统,噬菌体进化出了CRISPR蛋白。抗CRISPR蛋白允许噬菌体通过抑制CRISPR-Cas系统的各种成分来规避基于CRISPR的免疫,如AcrIIC2抑制Cas9与sgRNA结合,从而阻止活性核糖核蛋白复合物的形成AcrIIA4和AcrIIC5阻断Cas9靶向DNA结合AcrIIC1抑制HNH核酸内切酶结构域并阻断DNA切割。

近期,多伦多大学Karen L. Maxwell实验室研究了来自副流感嗜血杆菌原噬菌体CRISPR蛋白AcrllC4Hpa结构与功能

之前已经有研究表明,AcrllC4Hpa能够抑制副流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟氏菌等Cas9活性。经测试,课题组发现脑膜炎奈瑟氏菌的Nme1Cas9及与之有88%序列同源性的Cas9突变体Nme2Cas9均对AcrllC4Hpa的抑制敏感。为了确定AcrllC4Hpa的结合位点,课题组用6His标签标记Cas9,通过亲和层析,发现Cas9能与AcrllC4Hpa共洗脱,证明了两种蛋白形成稳定的复合物;为了确定AcrllC4HpaCas9哪个结构域结合,课题组使用分离的Cas9结构域与AcrllC4Hpa进行亲和层析,发现AcrllC4Hpa能与REC叶中的REC2结合共洗脱,即证明AcrllC4HpaREC2结合。

为了研究AcrllC4Hpa活性对DNA结合的影响,课题组建立了体内转录抑制实验,使用组成型人工启动子驱动大肠杆菌lux操纵子的表达。当不存在AcrllC4Hpa抑制时,sgRNA介导Nme1Cas9切割启动子,从而抑制细胞生长;当抗CRISPR蛋白阻止Nme1Cas9切割但不阻止与DNA结合时,Nme1Cas9结合到启动子区域阻止lux操纵子的转录,导致低水平发光;若抗CRISPR蛋白能阻止Nme1Cas9与DNA结合,则可以解除对lux操纵子的抑制,导致发光增强,结果发现AcrllC4Hpa存在下,细胞可以正常生长,但是抑制发光,因此得出结论AcrllC4Hpa允许Nme1Cas9与DNA结合,可抑制切割活性。此外,课题组用电泳迁移率改变分析、荧光偏振方法,结果均显示AcrllC4Hpa存在下,Cas9可以与DNA结合。最后,课题组对AcrllC4Hpa蛋白做了晶体结构分析与表面重要氨基酸残基的功能分析。

总的来说,课题组研究了来自副流感嗜血杆菌原噬菌体CRISPR蛋白AcrllC4Hpa结构与功能,证明了AcrllC4Hpa能抑制Cas9切割的功能,并不会抑制Cas9与DNA结合。相关研究发表在JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGYStructural and Mechanistic Insight into CRISPR-Cas9 Inhibition by Anti-CRISPR Protein AcrIIC4Hpa