合成生物催化剂摘译自:https://doi.org/10.1038/s41467-021-27004-1

在CRISPR-Cas系统介导的基因编辑中,单链寡脱氧核苷酸(ssODN)是常用的修复模板形式。但是单链模板DNA修复(SSTR)的机制目前仅利用Cas9蛋白在人类和酵母细胞中被研究过,尚不完全明晰,这对于进一步提升精确基因编辑系统是一个挑战。真核生物莱茵衣藻在自然界中拥有丰富的多样性,且基因组相对较小、仅含单倍染色体,在做基因编辑的实验体上有一定的优势。

近日,英国爱丁堡大学的Aron Ferenczi等人在Nature communications期刊上发表了题为Mechanistic and genetic basis of single-strand templated repair at Cas12a-induced DNA breaks in Chlamydomonas reinhardtii的文章,首次揭示了莱茵衣藻中用Cas12a引入双链断裂后的SSTR机制。莱茵衣藻是一种单倍体真核生物,生长快速且易于处理,具有注释良好,相对较小的单倍体基因组,在本实验中被作为实验对象。首先,作者通过三组实验确定了Cas12a引入双链断裂后的SSTR是通过单链DNA并入(ssDI)完成,而非合成依赖链退火(SDSA)。第一组实验基于ssDI和SDSA对底物要求的区别,ssDI过程由于模板需要整合进基因组,要求ssODN的3’末端有羟基团,SDSA则不需要。实验中以3’末端修饰去掉羟基的ssODN作为修复模板,观察到编辑频率的显著降低,表明ssDI可能是SSTR的一种主要形式。第二组实验是在ssODN5’和3’某些位置引入SNP,根据作用原理,ssDI中5’和3’位置的SNP都可以造成基因编辑,SDSA中仅有5’位置的SNP会造成基因编辑,实验结果显示ssODN两侧同源臂上的SNP会以类似的效率在双链断裂区两侧对称引入基因编辑位点,表明ssDI是SSTR的一种主要形式。第三组实验是用生物素标记的ssODN作为修复模板,发现生物素标记的片段整合进入了基因组,为ssDI参与SSTR提供了直接证据。

随后,作者通过同源比对确定了莱茵衣藻中基因修复过程中的关键酶,通过敲除不同修复途径中的关键酶,与野生型比较SSTR效率,确定了聚合酶θ在莱茵衣藻Cas12a诱导DNA双链断裂的修复中特异性介导了几乎所有的SSTR。

综上,本研究以莱茵衣藻作为研究对象,确定了其中Cas12诱导双链断裂修复的SSTR机制,为改进精确基因编辑系统提供了思路,并暗示莱茵衣藻有成为基因修复研究模式生物的潜力。