合成生物催化剂工程,摘译自:https://www.researchsquare.com/article/rs-889623/v1

大肠杆菌BL21菌株是用于重组蛋白生产和代谢工程的最常用菌株之一。高效、简便地修饰BL21菌株的基因组对于进一步提高菌株的工业应用性能是十分必要的。近年来,CRISPR-Casλ重组系统的联合使用已成为编辑大肠杆菌基因组的常见手段,其中杨晟等在人2015年所建立的pCas/pTarget系统已被广泛使用(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System);但后来发现pCas/pTarget系统中锚定pTarget质粒上pMB1复制子的gRNAB系大肠杆菌中有渗漏表达,难以用于编辑B系大肠杆菌,因此杨晟等人在2021年对pCas/pTarget系统进行了优化获得升级版的pEcCas/pEcCas系统(A modified pCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assisted genome editing in Escherichia coli)。近期,来自新加坡食品与生物技术创新研究所的研究人员也对pCas/pTarget系统进行了优化,利用优化后的系统可成功对大肠杆菌BL21进行基因组编辑,并通过代谢工程改造案例证实了CRASH系统的应用性,相关研究发表在近期的Metabolic Engineering杂志上:Metabolic Engineering of Escherichia Coli BL21 Strain Using Simplified CRISPR-Cas9 and Asymmetric Homolog Arms Recombineering

在本研究中,作者将来自枯草芽孢杆菌的sacB基因置于pTarget质粒上,便于后续在蔗糖平板上丢除pTarget质粒;然后删除pCas质粒上锚定pMB1复制子的gRNA表达框。获得这个新系统之后,作者首先以adhE基因上的5个位点测试了该新系统,然后进一步以约15%的效率删除了BL21基因组上长10 kb的序列。为了进一步简化实验方案,作者设计了非对称同源臂,即一侧为短同源臂(为50bp),另一侧为长同源臂(为500bp),短侧同源臂可设计在引物中,因此可通过单轮PCR获得上下游同源臂。作者将这种质粒元件及同源臂优化后的系统命名为CRASH。利用CRASH成功敲除BL21基因组上的27个基因;该系统同时也被用于多基因删除(2基因)。此外,作者对gRNA的设计也做了研究,他们结果表示当gRNA锚定在正义链且靠近下游同源臂或gRNA锚定在负义链且靠近上游同源臂时,可观察到略高的编辑效率。最后,作者为了应用CRASH,他们针对在BL21基因组上迭代删除7个基因,由此产生的菌株将番茄红素的产量从~15,000 ppm增加到> 40,000 ppm

尽管CRASH在基因删除上简化了操作流程,但对于整合20bp及以上的序列时,仍然需要同时扩增上下游同源臂至质粒或涉及重叠PCR

(李琦 摘译)


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