CRISPR介导多重基因整合用于重构马克斯克鲁维酵母莽草酸途径增产苯乙醇

合成生物催化剂,摘译自:

https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-020-01852-3

2-苯乙醇(2-phenylethanol 2-PE)是一种玫瑰香味的香精和香味化合物,被广泛应用于各种用途,如食品、饮料和个人护理产品等,与汽油混合物的相容性使之有希望成为下一代生物燃料。作者通过重构改善莽草酸通路增强马克斯克鲁维酵母合成2-PE的能力。

202116日,加利福尼亚大学Mengwan Li等人在Biotechnology for Biofuels期刊发表了题为CRISPR-mediated multigene integration enables Shikimate pathway refactoring for enhanced 2-phenylethanol biosynthesis in Kluyveromyces marxianus的研究。

 

莽草酸途径是植物和微生物以葡萄糖和其他可发酵糖为原料合成2-PE的通路,如上图所示,由糖酵解产物磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途径产物4-磷酸赤藓糖可生成大量的芳香族氨基酸,分支酸是第一个分支点,可以产生色氨酸和预苯酚,预苯酚可转化为L-酪氨酸,酪氨酸可对DAHP合成酶(DAHP synthaseARO4)和分支酸变位酶( chorismate mutaseARO7)起到负反馈调节。预苯酚在预苯酚脱水酶(prephenate dehydratasePHA2)催化下生成苯乙醛,进入Ehrlich途径,生成2-PE2-PE在乙醇乙酰转移酶(ethanol acetyltransferaseEAT1)催化下生成2-苯基乙醇苯乙酸酯(2-phenylethyl acetate 2-PEAc)

 

菌株与CRISPR位点的选择

由于马克思克鲁维酵母对于50℃具有耐热性,且能代谢各种C5C6、和C12糖,生长速度快速,因此作者选用马克思克鲁维酵母作为研究2-PE合成的模型。利用同源质粒pHD与目标序列上下均有700bp同源序列,将单个或多个基因整合到单个基因座。a表示用三引物PCR法检测验证有三个基因被整合到ABZ1基因座。Bc表示选取了5个适合高效整合的基因组位点,分别为URA3XYL2ABZ1SDL1LYS1,使用荧光报告基因EGFPYFPDSRED检测每个位点上的外源基因整合效率,即单基因(EGFP)、双基因(EGFPDSRED)、三基因(EGFPYFPDSRED)的整合,其中URA3单基因整合效率最高,为95±8%。最终选择ABZ1作为位点,原因是其双基因效率为49±7%,三基因整合效率为51±9%

 

缓和莽草酸途径的反馈抑制

 

ARO4ARO7受到酪氨酸的反馈抑制,突变型酿酒酵母ARO4K229LARO7G141S对反馈不敏感,通过过表达了一系列突变型ARO4ARO7基因,与突变型酿酒酵母对比来评估马克思克鲁维酵母的反馈抑制。实验通过2-PEAc的滴定度来测定2-PEAc的产量,结果表明,马克思克鲁维酵母ARO4K221L突变使得产量由31±7 mg/L增加至202±16 mg/L;而用酿酒酵母的ARO7G141S马克思克鲁维酵母ARO7G141S突变来测试ARO7的反馈抑制的减缓,发现未能增加产量,考虑到合成能力没有太大差异,因此选用KmARO4K229LKmARO7G141S进行重构。

 

通路启动子的验证

 

选择3个在马克思克鲁维酵母中广泛表达的启动子——PKmTEF3PKmPGKPKmTDH3,在低拷贝数质粒上过表达EGFP,比较3个启动子的强度,图a表示30℃下质粒过表达后检测EGFP荧光量,PKmTEF3表现出最高的表达;图b表示温度对于表达的影响,在37℃时,PKmTEF3PKmPGK的强度比30℃时降低了约70%,而PKmTDH3的表达比30℃时降低了88%。在45℃时,PKmTDH3驱动的外源基因表达进一步减少,仅为30℃时的10%45°CPKmPGKPKmTDH3的表达量与37°C时相当。

 

莽草酸途径重构

 

a表示建立一个容量为33的莽草酸途径中三个关键基因——PKmTEF3PKmPGKPKmTDH3的可变表达组合库,即启动子的27个组合表达KmARO4K221LKmARO7G141SKmPHA2的文库;bc表示分别在303745℃的25mlYPD培养基中培养72h后,2-PE2-PEAcPP的积累量。结果表明随着温度的升高,2-PE的生成量降低,重构所带来的影响效果变小。

 

 上图表示三个启动子27组合分别在303745244872h2-PE2-PEAc生成测量其中 45(PKmTEF3)KmARO4K221L-(PKmTEF3)KmARO7G141S-(PKmTEF3)KmPHA2通路表现最佳;37(PKmPGK ) KmARO4K221L-(PKmTDH3)KmARO7G141S-(PKmTEF3)KmPHA2通路最佳30时,PKmTEF3KmARO4K221L-(PKmPGK)KmARO7G141S-(PKmTEF3)KmPHA2通路最佳

Ehrlich途径的改造

 

为了尽可能多产2-PE,可通过敲除ARO8基因来增加Ehrlich通路通量,但是在培养72h之后,ARO8的敲除对2-PE合成几乎没有影响。在PKmTEF3驱动下,整合在URA3位点的ARO10过表达使2-PE2-PEAC产量增加10%146%EAT1会将2-PE乙酰化为2-PEAc,可通过CRISPRi技术删除寄生虫通路中EAT1基因。最终,30℃时在20g/L的葡萄糖中培养72h后,2-PE的产量为766±6mg/L,此时2-PEAc含量最少。

  综上所述,作者通过在马克思克鲁维酵母中建立有效的多基因整合路径,利用CRISPR导的多基因整合KmARO4K229LKmARO7G141S,来减缓酪氨酸的反馈抑制,删除EAT1阻止2-PE乙酰化生成2-PEAc,过表达ARO10,最终达到2-PE高产的目的。


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