头孢菌素C酰化酶(CCA)可催化头孢菌素C CPC)裂解为7-氨基头孢烷酸(7-ACA),而7-ACA是一系列半合成抗生素的关键中间体。如何高效、低成本的生产CCA成为了酶法7工业生产7-ACA的关键。增强CCA的表达无疑是一种有效的手段。以往研究表明,基因表达受多种因素调控,包括启动子强度、顺式和反式作用因子、细胞生长阶段及各种RNA聚合酶相关因子等。在这些因素中,启动子是一个至关重要的因素。利用启动子工程通过突变、增强或改变启动子DNA序列来调节启动子转录能力是蛋白表达改造的常用手段在大肠杆菌中,诱导型启动子例如T7tet等强启动子具有蛋白表达高产,对细胞生长的影响较小等特点但在外源基因过表达时,强启动子往往会导致包涵体的形成,进而降低了蛋白表达效率。利用组成性启动子调控蛋白表达是降低包涵体形成的一种策略。与诱导型启动子相比,组成型启动子具有以下优点:1.不需要诱导,能有效降低发酵成本;2.多数组成型启动子可以葡萄糖为碳源进行表达,因此无需在表达时更换碳源更利于高密度发酵3.目的蛋白可以在细胞生长的各个阶段不经诱导表达,并且可以在较短的发酵时间内达到最高产量。
  近日,北京科技大学的罗晖等在Applied Biochemistry and Biotechnology杂志发表文章Optimization of Cephalosporin C Acylase Expression in Escherichia coli by High-Throughput Screening a Constitutive Promoter Mutant library,文中作者首先构建了3个由组成型启动子调控的CCA-GFP基因工程大肠杆菌,并将GFP亮度与CCA活性进行关联,以此为依据从中选择调控效果最好的启动子BBa_J23105,并对该启动子进行了饱和突变。而后作者利用流式细胞荧光分选技术荧光强度和酶活增强的启动子突变库进行了筛选,从中选出了11株表达不同程度增强的突变株。11个不同菌株的启动子转录强度和蛋白表达的分析,证实启动子突变导致荧光强度和酶活性增加。

  最佳启动子突变体的CCA酶活性在摇瓶条件下提高到原菌株的3.47(突变株产量达到12772U/L出发菌株产量为3678U/L并且相较于T7启动子也增加了22.8%T7启动子产量为10400U/L)。5L发酵条件下提高到原菌株的4.05,尽管CCA活力在发酵后期(约16h后)迅速下降,作者推测这是由于培养基中的营养物质不足以维持发酵后期细胞的合成代谢菌体步入衰亡所致,但T7启动子相比,由组成型启动BBa_J23105调控的CCA表达具有不形成包涵体、不需要诱导剂、操作简单、成本低等优点,具有良好的工业应用前景。

                                                                                                                                                           (张逸原摘译)


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