生物催化剂工程

摘译自:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00073

目前,新一代DNA测序与低成本DNA合成技术提供了海量的基因资源与快速廉价的基因获取手段,为设计和创制理想的生物催化剂提供了近乎无限的可能性。在合成生物学与代谢工程改造中,基因剂量的优化是提高合成生物催化剂性能的重要环节。由于质粒存在可用复制子有限、拷贝数不稳定等局限性,因此,将基因表达盒整合至染色体上进行剂量优化或许是个更好的选择。然而,即使在模式菌株大肠杆菌中,染色体上每轮整合也至少需要两天,难以快速获取含一系列不同拷贝数的基因表达盒的工程菌株进行筛选优化。

2020617日,中国科学院上海植物生理生态研究所杨晟课题组在ACS Synthetic Biology发表文章“Multicopy chromosomal integration using CRISPR-associated transposases”,实现目的基因在染色体上无需筛选标记、快速、定点的多拷贝整合。2019年,NatureScience曾分别发表Samuel H. Sternberg和张峰实验室开发的CRISPR相关转座系统——INTEGRATECAST,本文基于这两个系统进行了拓展与应用,建立了CRISPR相关转座介导的染色体多拷贝整合方法(Multicopy chromosomal integration using CRISPR-associated transposases,简称MUCICAT)。首先,作者在大肠杆菌中选择天然多拷贝的插入序列作为靶向位点,尝试使用以上两个系统进行多拷贝整合。在大肠杆菌Pir1中,使用CAST系统靶向5拷贝的IS1序列位点,经过一轮转座,发现仅整合1拷贝货物基因,传代后也未能分离得到多拷贝插入的菌株。然而在大肠杆菌BL21(DE3)中,使用INTEGARTE系统靶向染色体28个拷贝的IS1序列位点,可以在一轮转座后得到最多整合4拷贝货物基因的菌株。随着传代时间的延长,货物基因在染色体的插入拷贝数也不断增加,传代8次后得到染色体插入16拷贝货物基因的菌株。之后,作者尝试组装多个crRNAcrRNA 阵列,靶向染色体不同的期望位点,发现靶向染色体8个不同位点时,经过5轮传代转座,可获得8位点全部插入的菌株。最后,作者使用MUCICAT技术在大肠杆菌BL21(DE3)中进行工业酶葡萄糖脱氢酶的表达优化,建立不同拷贝数的菌株文库并筛选后,染色体6拷贝整合菌株的酶活可达目前主流pET24a质粒表达的2.6倍。此外,作者为测试MUCICAT技术能否拓展至更多的细菌中,在维生素C生产方面有应用潜力的柠檬塔特姆氏菌中进行了测试,靶向该菌染色体上13拷贝的多拷贝位点时,结果显示一轮传代后100%的菌株的13个位点均整合了货物基因,说明MUCICAT技术有希望应用于更多的细菌中。

总体来说,MUCICAT依赖其可编辑性、无筛选标记、定点快速的染色体多拷贝能力,有望成为合成生物学与代谢工程中加速菌株改造、优化菌株性能的有力工具,革新细胞工厂构建方式。作者文中靶向大肠杆菌染色体不同拷贝插入序列和不同位点的转座质粒以及一步快速消除转座质粒的pCutamp质粒组合为MUCICAT工具包,相关质粒可后续从Addgene或MolecularCloud获取。

 

(张译文 摘译)


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