210日,Biotechnology and Bioengineering 杂志在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所杨晟课题组的研究成果CRISPR‐Cas9D10A nickase‐assisted base editing in solvent producer Clostridium beijerinckii

拜氏梭菌是一产孢、产溶剂的革兰氏阳性细菌,它能利用各种碳源底物生成有价值的化学品和生物燃料,是重要的工业菌株。在拜氏梭菌中建立完善的基因组编辑工具不仅方便构建高效鲁棒的工程细胞,还能用于深入地理解其生理学。拜氏梭菌中已有多种基因组编辑方法,如基于二类内含子的基因失活技术Clostron/Targetron。二类内含子技术虽然快速,但具有极性效应,对于较短基因可能找不到合适的内含子插入位点,再者,该方法并没有实现基因的删除,有可能无法完全中断目标基因的功能;最后,该方法不能对基因进行精细操作,如同框缺失和大片段插入及碱基突变。除此,依赖同源重组的等位交换的基因组编辑,该方法需经历单、双交换两个过程,常借助反筛标记基因来促进筛选双交换突变菌株,但由于受限于单交换的低效率,使得整个基因组编辑周期耗时较长。之后,我们在拜氏中建立了基于CRISPR的基因组无痕编辑方法pNICKclos2.0,能在转化子中直接获得敲除菌株,但受限于质粒的转化效率和拜氏梭菌中较低的同源重组修复效率,上下游同源臂需同时放在一个质粒上,构建过程繁琐。因此,有必要在拜氏这种低同源重组修复效率的微生物中建立不依赖于同源重组的基因组编辑方法。

近年来,有不少研究将碱基编辑器与CRISPR-Cas系统结合使用,绕开同源重组进行基因组编辑。利用CRISPR-dCasCas9刻痕酶系统将胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶定位至靶标基因组位置,利用酶催化反应实现有效窗口内胞嘧啶(Cytosine, C)和胸腺嘧啶(Thymine, T)或鸟嘌呤(Guanine, G)和腺嘌呤(Adenine, A)的转换。该过程不涉及Cas9切割基因组形成双链断裂缺口,同时也不需要同源臂的供给。

在本研究中,我们首次在拜氏梭菌NCIMB 8052中建立了碱基编辑系统pCBEclos,实现了靶标位点处由C·TT·A的转换。使用密码子未优化版本的胞嘧啶脱氨酶和糖基化酶抑制子(pCBEclos质粒)能在8052中工作,但效率低,需经过筛选培养基才能获得突变株,如在5-FOA平板上筛选pyrE突变株,不适用于普通基因;而根据梭菌密码子优化相关元件后(pCBEclos-opt质粒)编辑效率提高,可直接在8052转化子中获得突变株或固体划线传代一次后获得突变菌株。使用pCBEclos-opt质粒实现了对拜氏梭菌pyrExylRspo0AaraR基因的编辑,编辑质粒在液体无抗培养基传代2次之后可丢除,以便进行此轮的基因组编辑。与之前建立的pNICKclos2.0相比,该工具无需供体DNA的提供,将构建引物从6条缩短到2条。

该工具能在拜氏梭菌中快速实现碱基突变,无需供体DNA的提供,构建过程简便,可加速对拜氏梭菌基因组的改造和对拜氏梭菌的研究。同时,pCBEclos-opt系统的建立可为其他同源重组效率低的细菌提供参考。

       本研究得到了国家自然科学基金委和上海自然科学基金委的支持。

 

  


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