合成生物催化剂工程,摘译自:

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab752/6363765

        设计与调试微生物细胞工厂常需要中断一批基因和/或调试一批基因的最优剂量比。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑工具受限于同源重组效率,难以同时编辑4个以上靶点,特别是基因整合,这就需要费时的多轮编辑。已发现有6CRISPR相关转座酶(CRISPR-associated transposases, CASTs)可不依赖同源重组进行细菌染色体DNA整合。前期,中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨晟实验室将其中活性最高的一种部署为基于CRISPR-转座系统的多拷贝染色体整合工具(Multiple chromosomal integration by CRISPR associated transposase, MUCICAT,应用于重组蛋白质表达基因剂量优化(Zhang et al., ACS Synth Biol, 2020),并展示了其在代谢工程中多重基因中断这一优势(Zhang et al., CRISPR J, 2021)。

202193日,杨晟实验室在Nucleic Acids Research 发表的题为“Orthogonal CRISPR-associated transposases for parallel and multiplexed chromosomal integration”中进一步挖掘到来源于半透明假交替单胞菌Pseudoalteromonas translucida)的第7CAST,称为PtrCAST。其不仅在大肠杆菌中也具有多拷贝染色体编辑的高活性,且不受PAM限制,可以容忍除4个核苷酸的种子序列外的间隔序列错配。在测试的组合下,PtrCAST能与原MUCICAT正交使用,以各自的CRISPR 阵列将各自的负载DNA互不干扰地整合在大肠杆菌染色体上的52个位点。这一正交MUCICAT为细菌基因组编辑提供了一个强有力的工具。

左图:7种CRISPR相关转座酶效率比较  右图:正交MUCICAT示意图

 


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