合成生物催化剂,摘译自:

novel global transcriptional perturbation target identified by forward genetics reprograms Vibrio natriegens for improving recombinant protein production | Acta Biochimica et Biophysica Sinica | Oxford Academic (oup.com)

需钠弧菌是已知代时最短的自由生活细菌,传代时间小于10min。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在作为宿主表达外源蛋白时,有望缩短发酵周期,在工业生产中节约能量和时间成本,有潜力作为大肠杆菌以外的新一代蛋白表达系统。近年来关于需钠弧菌重组表达的优化报道仅限于发酵优化,尚未有任何报道对需钠弧菌宿主本身做有利于蛋白表达的改造。

蛋白质表达是一个复杂、高成本和耗时的过程,某些未知因素会导致蛋白质的生产不理想。以研究成熟的大肠杆菌为例,有很多研究对大肠杆菌宿主进行了优化,由于对需钠弧菌的研究刚刚起步尚不成熟,直接套用大肠杆菌的理性改造靶点并不一定有效能成功。诱变辅以高通量筛选的正向遗传学方法无需对表达过程有彻底的机制理解,是获得蛋白质表达底盘的有效方法。色谱方法和GOIC端融合GFP再以FACS筛选高荧光值单细胞不依赖GOI特异性,其中FACS通量高达每批实验109 ~ 1010/小时,是一种快速、可靠的高通量筛选方法。

20216月,徐佳琪等人在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊发表研究论文A novel global transcriptional perturbation target identified by forward genetics reprograms Vibrio natriegens for improving recombinant protein production。提出将GOIC端与GFP融合表达后的诱变菌株即可用FACS检测单细胞的荧光信号,从而获得重组表达能力提升的需钠弧菌底盘。首先,作者选择在大肠杆菌中可溶表达强但在需钠弧菌中微弱的一种ω-转氨酶,将其3’末端与GFP融合,通过紫外诱变和FACS筛选获得突变株能使该ω-转氨酶表达量和酶活均提升的底盘菌,且提高其他3GOI的可溶表达量。重测序和遗传重构发现,内源RNA聚合酶β’亚基的基因rpoC保守位点Y457突变是提高重组蛋白表达的原因。我们推测rpoCY457突变应是通过复杂的方式影响细胞内各基因的转录,从而提高需钠弧菌中pET质粒的拷贝数和某些GOI的重组表达,且拷贝数的提高有可能是提高GOI表达的原因之一。

GFPGOI融合表达结合FACS筛选是蛋白质高表达底盘的强有力正向遗传学工具,针对更多GOI发现更多增产靶点后,可用于构建新一代蛋白表达底盘。

 


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