合成生物催化剂工程

pET系统被广泛用来表达外源重组蛋白，目标蛋白基因置于T7启动子下游，而T7启动子只能由T7RNA聚合酶起始转录。T7RNA聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的RNA聚合酶的转录速度快约8倍。大肠杆菌BL21(DE3)是常用的表达外源重组蛋白的优秀原核宿主。尽管从BL21(DE3)已进化发展出了多种变种宿主，但是对某些蛋白的表达仍然不是那么高效。以常用的生物催化酶葡萄糖脱氢酶（GDH）为例，发酵后期OD及酶活出现下降的情况，扫描电镜显示了大肠杆菌出现了自溶，且该种自溶不依赖于酶自身的活性。重要的是，自溶现象在工业生产另10种酶时也存在。这导致了无法通过延长发酵时间而增强酶活，不利于工业酶生产成本的降低。目前，针对易自溶蛋白，还未开发专门应对的表达宿主。因此，构建一株不会自溶的且通用的大肠杆菌宿主底盘菌株对工业化更具意义,更为通用和方便。

2020年8月30号，中科院杨晟实验室与南师大孙小曼博士合作在Biotechnology and Bioengineering 发表文章“Downregulation of T7 RNA polymerase transcription enhances pET-based recombinant protein production in Escherichia coli BL21 (DE3) by suppressing autolysis”构建了一株耐自溶大肠杆菌BL21 (DE3-lac1G)。作者尝试通过单敲除及多敲除了BL21(DE3)中已报道的程序性死亡通路，结果表明以上策略都无法彻底改善自溶现象。作者猜测蛋白表达的速度可能是造成自溶的主要原因，因此进一步尝试从PET系统进行改造。通过lac启动子降低T7RNA聚合酶的表达量虽导致了较低的酶活，但是却未出现自溶的现象。因此我们将弱的lac启动子和强的lacUV5启动子做了杂交，尝试寻找更合适的蛋白生产速度。结果表明只需改变lac启动子中的一个碱基（+1位的A变成G，命名BL21(DE3-lac1G)），就可以大幅度抑制宿主自溶的现象，发酵后期收集到的GDH酶活从37.5 U/mL大幅提高到452.0 U/mL。重要的是，在发酵后期，出发菌株BL21(DE3)中的质粒存在率为0，而工程菌株BL21 (DE3-lac1G)的质粒存在率为96.5%，进一步表明了工程菌株在发酵过程中的高稳定性。重要的是，BL21 (DE3-lac1G)也能成功改善酰胺水解酶、CPC酰化酶、甲酸脱氢酶、R-羰基还原酶、L-乳酸脱氢酶、L-2-羟基异己酸脱氢酶、L-苯丙氨酸脱氢酶、仲醇脱氢酶等多达10种蛋白的表达。这表明该抗自溶宿主具有重要工业应用价值。

（孙小曼  摘译）