合成生物催化剂摘自:https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00135

 

酵母一直是通过异源生物合成途径重建复杂和有价值的天然产物生物合成的多功能模型宿主。天然产物途径阐明的最新进展揭示了许多大型而复杂的植物途径用于生物合成结构复杂、有价值的天然产物。然而,在酵母中有效重建超长通路的能力无法满足对有价值的植物天然产物生物制造日益增长的需求。

近日,康奈尔大学Sijin Li等人在ACS Synthetic Biology在线发表文章MULTI-SCULPT: Multiplex Integration via Selective, CRISPRMediated, Ultralong Pathway Transformation in Yeast for Plant Natural Product Synthesis,开发一种高效的CRISPR/cas9辅助通路构建方法-MULTI-SCULPT,其可以将21个DNA插入物,包括12个异源通路基因,以一锅的方式直接整合到酵母染色体中。在MULTI-SCULPT方法中,包含长生物合成途径的酵母菌株在12天中通过3步骤被构建和验证。第一步,构建基因表达盒,通过将每个酶编码的基因组装成一个预先组装的质粒,其中包含一个独特的酵母启动子和终止子对。基因表达盒通过25bp的同源臂扩增,延伸到目标酵母整合位点或其位点内的相邻盒,产生重叠的线性整合插入,允许逐步重组。从酵母基因组DNA中扩增出CRISPR靶标两侧的额外500bp同源序列,以帮助通路基因的定点整合。第二步,设计一个多位点CRISPR/Cas9载体以诱导特定染色体位点的DSB作为整合位点。将线性插入和CRISPR/Cas9载体一起转入酿酒酵母中。第三步,通过将细胞在适当的选择培养基上培养3-4天,然后进行液体培养基培养和使用质谱进行产品鉴定,来选择成功的整合。为了开发和证明MULTI-SCULPT多基因整合的方法,作者选择异黄酮生物合成途径作为重建的合适靶点。研究发现8基因通路整合到双位点的效率为100%。将包含12个基因植物异黄酮生物合成途径的21个DNA 插入片段整合到三位点,在12天内成功率达到 90-100%。

  综上所述,MULTI-SCULPT方法可以实现多位点的超长生物合成途径整合

 

(朱娇 摘译)


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