合成生物催化剂摘译自https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.06.17.496590v1.full

  在进化的长河中,CRISPR系统被Tn7样元件捕获而形成了RNA引导的转座系统CASTs(CRISPR-associated transposons),其分子功能依赖于RNA引导的CRISPR效应子和转座酶模块的协同作用。其中V-K型CASTs依赖于假核酸酶Cas12k、AAA+ ATP酶TnsC、锌指蛋白TniQ和转座酶TnsB的协同活性,但到目前为止,其机制细节仍然难以捉摸。2021年,来自法国苏黎世大学的Martin Jinek课题组和来自美国国立卫生研究院的Elizabeth H. Kellogg课题组分别在《Nature》和《Science》期刊上发表文章报道了来自霍夫曼伪枝藻(Scytonema hofmanni)的V-K型ShCAST转座子的结构,建立了转座过程模型,但在TniQ所处的位置以及其发挥的作用上,两篇研究基于结构解析提出了不同的假设,Martin Jinek等人的研究认为TniQ位于TnsC螺旋远离Cas12k的一端,限制TnsC的继续螺旋延伸,而Elizabeth H. Kellogg等人的研究认为TnsC聚合螺旋在DNA上随机启动,并通过与目标位点结合的Cas12k和TniQ的相互作用选择性地稳定,即TniQ位于TnsC螺旋靠近Cas12k的一端。
  近日,Martin Jinek课题组在《bioRxiv》上发表预印本“Structural basis for RNA-mediated assembly of type V CRISPR-associated transposons”,进一步对ShCAST的结构进行了解析。首先研究重构了在TnsC、TniQ存在下,RNA引导Cas12k靶向DNA的构象,并得到了分辨率为3.3Å的冷冻电镜照片。在复合物中,Cas12k以RNA和PAM依赖的方式结合DNA,1个TniQ蛋白和sgRNA中的tracrRNA部分、2个TnsC蛋白直接相互作用从而连结了Cas12k和TnsC螺旋,TnsC以右手螺旋方向组装朝着远离Cas12k的方向延伸,结构直接回答了TniQ的位置问题。令人出乎意料的是,研究人员在结构中意外发现了与TniQ一起纯化出来的大肠杆菌核糖体蛋白S15,S15和Cas12k、sgRNA的tracrRNA部分存在相互作用。另外,研究也发现了一些无TniQ和S15的蛋白复合物,其中Cas12k-sgRNA结合在DNA上,而TnsC朝着Cas12k的方向延伸,且与Cas12k-sgRNA没有直接的相互作用,R环仍然是不完整的形式,这是一种TnsC自动聚合的非活性结构。研究发现,当TniQ和PAM远端的sgRNA-TS靶向链结合以及Cas12k的构象发生重排时,R环得以完全形成。进一步的,文章对TniQ、TnsC、S15的功能及相互作用进行了研究。其中TniQ识别tracrRNA和R环,结构上被限制在tracrRNA的rooftop loop(顶环)、TnsC螺旋细丝和R-loop PAM远端的crRNA-TS duplex 之间,通过相互作用使tracrRNA中结构上原本无序的部分形成顶环(rooftop loop),与PAM远端的R环存在相互作用,横跨2个TnsC,TniQ C端的锌指结构域和N端的HTH结构域分别与2个TnsC存在相互作用,这说明TniQ通过顶环与tracrRNA相互作用,对R环的形成具有关键作用,同时促进TnsC的招募与螺旋细丝成核。TnsC螺旋在R环远端开始组装,其与NTS相互作用的关键氨基酸与之前报道的结合双链DNA的TnsC螺旋丝中的一致。但有趣的是在Cas12k-sgRNA-DNA-TnsC-TniQ复合物和无Cas12k的TniQ 覆盖的 TnsC螺旋中,TnsC分别以相反的方向螺旋延伸。对于S15,大肠杆菌的EcS15蛋白通过静电相互作用和π-π堆积作用与tracrRNA的顶环产生形状互补的相互作用,暗示S15能够通过稳定tracrRNA的顶环促进TniQ的招募。原宿主中的ShS15和Ec15具有58%的序列相似性,且参与和Cas12k、tracrRNA相互作用的残基序列几乎不变,暗示ShS15也是转座机器中的一个组分。为了验证这一猜想,研究进行了pull down实验,结果显示,Cas12k-sgRNA- DNA复合物可有效共沉淀EcS15和ShS15。当EcS15或ShE15和TnsC存在时,TniQ共沉淀明显增强,提示S15蛋白促进了TniQ与TnsC和Cas12k-sgRNA在靶DNA上的协同组装。研究在体外测试了EcS15和ShS15蛋白对转座效率的作用,结果显示EcS15和ShS15均大大提高了转座效率。最后,基于得到的结构基础,研究提出了新的转座过程模型。
  该研究揭示了CRISPR相关转座子的机制以及介导基因整合的基本步骤,为其发展为下一代基因组编辑技术奠定了机制基础。
图:V-K型shCAST中RNA介导的转座机器组装机制模型
(周晓杰 摘译)
 

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