合成生物催化剂 摘译自:

https://www.nature.com/articles/s41589-018-0121-5

 

1 PACE改善蛋白可溶性表达流程

2018820日,Nature Chemical Biology报道了哈佛大学David R. Liu实验室开发的称为可溶性表达噬菌体辅助持续进化技术(soluble expression phage-assisted continuous evolutionSE-PACE),可改善大肠杆菌目的蛋白的可溶性表达。 

PACE原理(图1):断裂T7 RNA聚合酶报告系统将待进化目的蛋白(POI)的可溶性表达、噬菌体次要外壳蛋白gIII表达和噬菌体增殖相关联。带有筛选噬菌体(selection phage, SP)的大肠杆菌宿主在固定容器不断被稀释,SP上编码gIII的位置被POI表达框取代,在辅助质粒(accessory plasmidAP)上以T7启动子表达gIII,而突变质粒(mutagenesis plasmidMP)的存在可以增加POI的突变频率,当SP上的目的蛋白获得合适突变时能诱导APgIII基因的表达,而gIII表达水平与后代噬菌体生产规模正相关。将T7 RNA聚合酶断裂为N端(T7n, 1-179)和C端(T7c, 180-883)结构域,T7nPOIC端构建融合蛋白(POI-T7n),当改善POI可溶性表达时,POI-T7nT7c形成功能性T7 RNA聚合酶,引发gIII表达后促进噬菌体增殖,远超过宿主稀释倍数而被富集,其中便带有可溶性改善的POI变体。为表征PACE可行性,研究者用细菌荧光素酶替代PIII,将可溶性表达差异的麦芽糖结合蛋白(MBP)变体与T7n融合,发现荧光信号与MBP可溶性表达水平的相关,与热力学稳定性也有较弱关系,说明T7 RNA聚合酶活性主要取决于MBP可溶性表达水平。

2 自剪切内含肽融合pIII双重PACE筛选。

但上述系统POI-T7n融合蛋白错误转录起始导致的截断版融合蛋白也能使SP不依赖POI的表达在筛选条件下存活。为解决该问题研究者进一步建立了同时双重筛选T7n表达和POI功能的升级版PACE。原理(图2)是利用点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的自剪切内含肽DnaEPIII分为两部分gIII1/2-IntNIntC-gIII 2/2,并分别在质粒AP1AP2表达,只有正确表达gIII1/2-IntNIntC-gIII 2/2获得功能性gIII才能使SP增殖。研究者测试了HA4单体与ABL1激酶SH2结构域的相互作用是否可通过内含肽-gIII系统对HA4可溶性和结合活性的筛选,发现只有T7n-HA4融合蛋白正确表达和保留结合活性的SP才能产生噬菌斑,说明该系统用于恢复目的蛋白结合活性的可行性。

随后,研究者用升级版PACE对大肠杆菌胞质中错误折叠和聚集的单链可变区抗体片段 (scFv)进化,仅3天就获得表达提高5倍且保留结合活性的scFv变体,仅5天就能由无二硫键的scFvs进化出稳定性增强的变体。进化获得胞苷脱氨酶APOBEC1变体可溶性表达改善、纯化蛋白产率提高,能改善哺乳动物细胞和大肠杆菌中碱基编辑器的效率。

以上表明,PACE可在保持目的蛋白功能的前提下,快速获得改善可溶性表达和稳定性的变体。

(刘金乐 摘译)


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