合成生物催化剂 摘自于:https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30582-3

CRISPR-Cas系统是原核生物的获得性免疫系统,他们是通过准确识别并破坏噬菌体或外源质粒来保护宿主。其是通过从外源基因中获取小片段核酸(~30ntspacer)整合至CRISPR列阵中的重复序列(repeat)中间,之后转录加工成成熟的CRISPR RNAs(crRNAs)用于向导Cas核酸酶实现准确免疫。在目前研究的CRISPR-Cas系统中, 其靶序列中需要含有前间隔相邻基序(protospacer adjacent motifPAM)来区别外源序列与自身序列,防止CRISPR-Cas系统的自我靶向。但在IIICRISPR-Cas系统和VI-A型的CRISPR-Cas13的研究中,均没有发现像Cas9中的NGG一样的PAM序列。对IIICRISPR-Cas系统研究发现除了的前间隔序列(protospacer)侧翼序列与CRISPR中重复序列高度匹配外,其他与spacer互补的序列均能被靶向切割。本文作者发现VI-A型的CRISPR-Cas13a也同样具有类似的特性。 

研究者在天然含有VI-ACas13 Listeria seeligeri 菌株中进行体内的功能验证,研究表明Cas13a可以防止含靶向序列的质粒的接合转移;并通过改变protospacer邻近的5nt的序列看其转移情况,并证实了先前的发现,即Cas13靶标没有PAM序列的要求,同时也发现了与CRISPR重复序列(5’-GTTT-3’)类似的GTTGTTT序列在protospacer下游出现时,外源序列和上述CRISPR转录的crRNA中的GTTGTTT互补形成双链,从而阻止了目标靶向切割。进一步研究protospacer下游与重复序列的相关性对切割的影响,表明在重复序列中前三位的核酸最为重要,即当protospacer下游连续三个核苷酸与重复序列相同时,便有明显的保护切割效果。进一步研究表明在protospacer下游序列(anti-tag)和向导RNA的重复序列(tag)之间互补的靶标不会被 Cas13切割(图1)。且表明VI-A系统是通过taganti-tag RNA配对,以保护宿主不受CRISPR-Cas的自我靶向。此外,体外表达Leptotrichia buccalis来源的Cas13研究发现含anti-tag RNA可以作为Cas13核酸酶的有效抑制剂,表明了VI-A系统的潜在调节机制。

1taganti-tag配对Cas13失活示意图

综上,此研究表明了VI-ACas13taganti-tag RNA配对对其有抑制作用,及有效向导Cas蛋白的crRNA序列及靶标序列的要求,此对cas13RNA检测,RNA成像和RNA调控时等应用中序列选择设计具有指导意义。

(杨萍 摘译)


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