合成生物催化剂摘译自:https://www.nature.com/articles/s41586-021-04030-z?WT.ec_id=NATURE-202111&sap-outbound-id=B507E3BE08832D2EA56F6D45ABC0C0800D72293C

CRISPR Cas系统通过Cas蛋白和crRNA对移动遗传原件进行核酸降解,一些核酸酶缺陷型I-F,I-B和V-K CRISPR Cas系统通过Tn7样转座子以不产生双链断裂的形式直接将DNA插入到特定靶位点,其中I-F3型CAST系统的DNA靶向机制已经被阐明。而对于V-K型CAST系统,普渡大学的Leifu Chang研究组解析了ShCAST系统在目标DNA结合前后Cas12k-sgRNA的结构,并鉴定了Cas12k识别PAM的关键残基,而康奈尔大学的Joe Peters、Liz Kellogg和Ailong Ke联合阐明了ShCAST系统的TnsC结构,冷冻电镜可视化表征TniQ-TnsC相互作用描述了TnsC聚合传递信息并介导精确基因插入的初步模型,但V-K 型系统的 DNA 靶向机制仍未被完全解析,各元件之间的相互作用仍待深入研究

近日,来自瑞士苏黎世大学的Martin Jinek课题组在《Nature》期刊上发表文章"Target site selection and remodelling by type V CRISPR-transposon systems",对 Scytonema hofmanni V-K型CAST系统(ShCAST)的DNA靶向机制进行了深入研究。课题组使用单粒子冷冻电镜技术解析Cas12k-sgRNA-dsDNA复合物的结构,证实了Cas12k是一种不能切割目标DNA的假核酸酶,表征了识别目标DNA PAM关键残基及其突变转座效率的影响课题组表征sgRNA的结构来自crRNA中央三链体结构转座活性至关重要,而用 GAAA 环取代 tracrRNA 的外围茎环不会影响转座效率,提出在基因工程应用中最小化sgRNA的方法。此外,课题组研究了TnsC、TnsB和TniQ在DNA靶向中的作用。通过使用负染色电子显微镜直接观察纯化的TnsC 的多聚化过程,课题组发现TnsC 聚合依赖于DNA ,需要 ATP 结合但不需要其水解,并会导致DNA螺旋的重塑,而关键残基突变实验表明TnsC 聚合、DNA与TnsC结合、DNA螺旋重塑和 ATP 水解对 ShCAST 的活性至关重要。通过亲和标记的TnsB与TnsC共沉淀实验和负染色电子显微镜观察发现TnsB 通过C端区域与聚合的 TnsC 相互作用并刺激其ATP酶活性,触发TnsC聚合物分解。研究确定了TniQ晶体结构,测试了TniQTnsCCas12k之间相互作用结果表明I型 CRISPR 转座子系统不同,ShCAST中TniQ 通过抑制TnsC的聚合与V-K型CRISPR效应子形成间接相互作用。

综上,该研究对ShCAST系统Cas12k-sgRNA-dsDNA复合物TnsCTniQ结构进行了解析,可以此前Leifu ChangJoe Peters等人的研究整合版本提出相较于Peters等人 V-K 型 CAST系统 Cas12k 依赖性 DNA 转座更全面的机制模型,加深了对V-K型CAST系统的理解,为 CRISPR 相关转座子作为可编程位点特异性基因插入工具的开发提供信息。

 

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图:Cas12k转座机制模型

(周晓杰 摘译)


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