合成生物催化剂工程

摘译自:https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab309/6270805?login=true


        细胞动态平衡是由多个基因的相互作用共同导致的,并随环境的变化而变化。因此,对人类细胞中遗传相互作用的系统研究可以为与复杂表型和疾病相关的协同基因提供见解。先进的基因编辑技术的发展,尤其是CRISPR-Cas系统,已经能够对人类细胞系中的基因依赖性进行大规模和系统的研究。目前,组合式CRISPR-Cas筛查技术可以绘制基因相互作用的图谱,但在大规模筛选下可靶向基因组合的数量仍有较大限制。CRISPR筛选的规模,鲁棒性,和可重复性由3个参数决定:CRISPR库多样性,库分布偏斜和实验覆盖率。多样性定义为不同gRNA或gRNA组合的总数,并随所需靶基因的数量而增加。库分布是所有gRNA或gRNA组合的丰度。在理想的文库中,所有gRNA序列都应丰富,但由于实际限制这无法实现。分布偏斜的数值可以测量均匀性,由最高和最低的丰富gRNA的比率定义。实验覆盖率描述了筛选期间每种gRNA或gRNA组合的平均丰度。目前CRISPR筛选库的覆盖率在200到1,000倍之间。目前已有许多CRISPR平台可用来生成满足多种应用需求的单基因和多基因CRISPR库。尽管如此,目前用于产生CRISPR库的方法仍需要PCR扩增和克隆,而这两种方法都可能导致高分布倾斜。因此,鉴于对单基因和多基因CRISPR库的需求不断增加,我们需要新方法来产生低偏斜度的CRISPR库。

 

        近日,法兰克福大学Kaulich等于Nucleic Acids Research发布文章“Minimized combinatorial CRISPR screens identify genetic interactions in autophagy”。文章描述了一种快速且可扩展的绘制方法,用于生成高度多样化且均匀分布的CRISPR库。课题组证明CRISPR库的分布偏斜是其所需筛查覆盖率的关键决定因素。通过绕过PCR扩增的迭代克隆,该方法可以促进低分布偏斜的CRISPR库的生成,同时以最小的覆盖范围筛选CRISPR库,从而减少相关工作量,并将成本降低至少10倍。

 

        我们在生存力和基于报告基因的富集筛选中应用了针对12736种自噬基因组合和247032对gRNA的CRISPR库。在生存力筛选中,我们确定了致命的WDR45B-PIK3R4和增强增殖的ATG7-KEAP1的遗传相互作用。在基于报告基因的筛选中,我们确定了自噬通量的1,570多种基本遗传相互作用,包括旁系同源基因之间的相互作用,即ATG2A-ATG2B,GABARAP-MAP1LC3B和GABARAP-GABARAPL2。

 

        然而,课题组没有观察到很多两个以上成员的同源基因家族中的遗传相互作用。这表明它们之间有功能性补偿机制。最后,这项工作建立了一个大规模进行遗传相互作用筛选的平台。

 

 

 

 

1. CRISPR gRNA库的建立方法。

 

(张介泽 摘译)


地址:浙江省湖州市红丰路1366号 湖州市南太湖科技创新中心1-3楼 邮编:313000
电话:0572-2165708 传真:0572-2165708 Email:info@cibt.ac.cn

Powered by PageAdmin CMS