合成生物催化剂摘译自:https://www.cell.com/trends/genetics/fulltext/S0168-9525(21)00053-6?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0168952521000536%3Fshowall%3Dtrue

  近日,来自哥伦比亚大学的Eric C. Greene团队在《Trends in Genetics》杂志上发表综述文章“DNA Repair Pathway Choices in CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing”。总结了关于CRISPR-Cas9切割位点修复的最新研究,梳理了与Cas9切割位点修复途径选择相关的影响因素。

  在真核细胞中,最常见的平末端修复途径包括:非同源性末端接合(Non-homologous end joiningNHEJ)、微同源末端连接 (microhomology-mediated end joining, MMEJ)、单链退火(Single strand annealing,SSA)和同源重组(Homologous recombination,HR)

 

NHEJ途径:

  NHEJ途径是真核细胞中常见的双链断裂修复途径。NHEJ途径的功能主要由多酶形成的NHEJ复合体来实现。但是NHEJ途径本身容易在修复位点引入突变。

  为避免Cas9产生的双链断裂被NHEJ途径修复、提高同源重组修复的比例,抑制NHEJ复合体功能是个有效的策略。具体的做法有:抑制连接酶IVLigIV)活性、加速连接酶IVLigIV)降解、抑制NHEJ复合体生成、抑制Ku蛋白表达等。

 

MMEJ途径:

  MMEJ途径由MRN(MRE11-RAD50-NBS1复合物及其伴侣CtIP (Cterminal binding protein interacting proteinC末端结合蛋白相互作用蛋白)共同激活,会切除部分双链末端。MRN复合物能阻碍Ku蛋白介入损伤修复。

  目前,科学界对调控MMEJ期间微同源序列退火的因素了解有限。ssDNA结合蛋白复制蛋白ARPA)可通过防止退火抑制MMEJ,而聚ADP-核糖聚合酶1PARP1)将DNA片段束缚在一起并促进退火反应。但是,关于MMEJPARP1的调控,有相互矛盾的证据。一些研究表明,PARP1通过与Ku竞争双链断裂位点进而促进MMEJ,而其他研究表明PARP1能促进Ku结合到双链断裂位点上。了解这些蛋白质因子之间的相互作用如何影响MMEJ至关重要。

  如果微同源序列位于DNA的最末端,则无需进一步编辑。相比之下,对于位于DNA末端远端的微同源性,必须通过XPF-ERCC1核酸内切酶(在酿酒酵母中称为Rad1-Rad10)或可能是另一种身份不明的核酸酶去除所得的异源3'ssDNA,以使DNA聚合酶能够介入]。 在哺乳动物细胞中,polθ通过模板指导的DNA合成来稳定退火的突出端并填补缺口。 一旦间隙被填满,剩下的切口就被DNA连接酶IIILigIII)或DNA连接酶ILigI)密封。

  多达58%的Cas9诱导的DSB通过MMEJ修复。 修复结果并非完全随机,可以在给定的DSB位点进行预测,表明在给定的DSB位点上切除的DNA末端之间的比对是可重现的,并且可能取决于局部序列背景。几条证据表明,Cas9切割位点缺失两个或多个核苷酸是最常见的结果。由此可以通过MMEJ实现了精确的无模板基因组编辑。

 

SSA途径:

  SSA途径与MMEJ途径在某些方面比较相似,都需要蛋白介入产生互补的粘性末端才能完成损伤的修复。然而SSA途径所需的末端切除长度远大于MMEJ途径。具体的修复机理,学术界尚无定论。

 

HR途径:

  同源重组依赖重组模板,能精确地基于模板完成损伤的修复。但是同源重组和SSA途径一样,涉及长距离末端切除。

   同源重组末端切除需要两个步骤,首先是MRN-CtIP介导的短距离切除,然后是涉及EXO1/BLM / DNA2的长距离末端切除。 关键的DNA末端切除因子的激活受细胞周期严格调节,并且主要限于细胞周期的S / G2期。

要点摘录:

1在真核细胞中进行准确的基因组编辑需要把握编辑的时机,并抑制NHEJMMEJSAA途径的相关蛋白的作用。

2DNA编辑结果在不同基因组位点之间差异很大[97,98],但是它们并不是完全随机的。 对于不依赖模板的修复途径(例如NHEJMMEJ),编辑结果受靶位点序列的影响很大。MMEJ的效率和修复结果在很大程度上取决于断裂前10 bp内的微观同源性

3、异染色质中存在的H3K9三甲基化(H3K9me2 / 3)标记可促进HRMMEJSSA,而常染色质中NHEJ修复为主。尚不清楚局部染色质结构如何影响DNA修复途径的详细机制,目前的研究正在尝试阐明染色质结构如何影响Cas9介导的基因组编辑。

4、越来越多的证据表明,在CRISPR-Cas9编辑过程中,靶位点可能发生大的缺失。当前的研究表明,大片段的缺失主要是由CRISPR-Cas9p53依赖性机制产生的DSB引起的。

 

四种修复途径

(徐毅诚摘译)


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