合成生物催化剂工程,摘译自: https://www.pnas.org/content/early/2020/06/24/2002307117

工业氮肥的出现,使得农业进入到了快速发展期。但由于工业氮肥存在大量硝酸盐成分,易转化为亚硝酸盐及二氧化氮,对空气及环境存在一定的污染,因此开发能够“固定”自身氮素的非豆科作物是减少农业中工业氮肥使用的重要途径。通过将固氮酶系统相关基因转入植物进行表达,特别是在线粒体、叶绿体中能够提高植物固氮的能力。这些细胞器可以提供固氮过程所需的还原力和ATP。好氧酵母线粒体中功能性铁蛋白的组装表明,线粒体可以为氧敏感固氮酶的工程提供合适的位置。固氮酶是一种复杂的酶,需要多种组分才能进行生物合成和活性。固氮酶的催化组分由两种金属蛋白组成:nifH编码的Fe蛋白和nifDK编码的MoFe蛋白。除了nifHDK编码的核心酶的结构亚基外,活性固氮酶的生物合成还依赖于各类Nif蛋白。通过将具有固氮能力菌体的相关基因在真核系统的线粒体或叶绿体中表达,使得固氮成为了可能。但是实验过程中发现,固氮酶的核心组分NifD在酵母及植物线粒体表达含量很低,且无法稳定存在。导致该系统的开发陷入了瓶颈。

近日,发表在《PANS》的“Using synthetic biology to overcome barriers to stable expression of nitrogenase in eukaryotic organelles”一文中(通讯作者为北京大学王忆平教授、杨建国研究员及John Innes Centre研究中心Ray Dixon教授),作者通过之前报道发现NifD蛋白在酵母和烟草中均发生了N端降解的现象,利用产酸克雷伯菌来源的NifD进行探究,发现R98是导致了降解情况出现的关键,通过进一步比对不同来源的NifD序列发现R98是保守的,通过突变获得R98K变体,发现降解不再发生,证明了R98位点是导致蛋白酶将其水解的关键。进一步,作者以大肠杆菌为底盘细胞,并将线粒体信号肽酶(mitochondrial-processing peptidase,MPP)与野生型NifD及突变体进行共表达,作者发现野生型NifD与MPP共表达时,R98位点为识别位点导致了MPP的错误切割使得NifD失去了活性,而突变体则不会被切割。通过饱和突变与活性检测,作者成功获得了在线粒体中高固氮酶活性和稳定性的NifD蛋白(R98P),为进一步开发固氮途径在植物和微生物中提供了新的方式。

 

(张子旭 摘译)


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