合成生物催化剂摘译自:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2020.00551/full

  目前我们对启动子在不同遗传背景下的可预测性和可组合性了解甚少。已有研究表明,不同数量的启动子串联导致活动增加。 但是到目前为止,还没关于启动子组合表达效果的研究,过去的研究集中在启动子活性、不同底盘细胞启动子可组合性和可预测性上。

  近日来自德国亚琛大学的Nick Wierckx团队在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》杂志上发表了名为“Characterization of Context-Dependent Effects on Synthetic Promoters”的文章阐述了启动子上下游序列和启动子组合对下游基因表达的效果的影响。

  研究首先以恶臭假单胞菌KT2440为底盘细胞探索了在协同表达情况下,两个启动子之间的最佳距离。将来自先前公开的合成启动子库的两个启动子进行了堆叠,其中间隔序列的长度从10 bp增加到100 bp,并在3'端延伸-结束。间隔子是随机生成的,经验证没有限制性内切酶识别位点以及疑似的核糖体结合位点-35-10样序列。 间隔子的GC含量为62%,类似于恶臭假单胞菌KT2440的基因组平均值。

  将无启动子的报告基因和野生型恶臭假单胞菌KT2440用作阴性对照。 作为阳性对照,我们使用了Zobel等人中所述的单个校准的启动子。包括达到启动子14g活性一半的Pem7。 当短间隔子序列<35 bp时,堆积的启动子的活性低于单个启动子的活性。 该结果可能是由于RNA聚合酶全酶的空间位阻所致,因为组合的sigma因子和RNA聚合酶覆盖了启动子上游约80 bp。 间隔子长度为40–7090–100 bp导致活动强度相当。 与其他间隔区长度相比,间隔为8​​0 bp14f_80_14g的活性明显更高。

  为了排除80bp的间隔区是由于可能的激活序列而导致的异常值,使用间隔区的反向互补序列(80i)重复了该实验。结果表明两个启动子之间的距离促进了两个启动子的加和活性。 有趣的是,间隔子长度为80 bp,与RNA聚合酶全酶所覆盖的序列匹配,但是这与启动子强度之间应该不存在因果关系。间隔子本身也没有表现出任何类似于启动子的效果。

   对于80i间隔子,发生了累积效应,堆积的启动子的总输出高于单个活动。 为了进一步表征,我们使用了80i间隔子,因为它可以实现最高的启动子活性。

   我们假设了如何影响这些堆积的启动子的两种可能方式。 主要假设是间隔子对启动子的影响。 另一种假设是一个启动子对另一个启动子的相互影响(Callen等,2004 Shearwin等,2005)。 为了检验这些假设,我们构建了14种不同的堆叠启动子组合和12个对照,以确定80i间隔子对单个启动子活性的影响。 遵循SEVA提供的规则(MartínezGarcía等,2015),启动子整合在限制性酶切位点PacIAvrII之间。 间隔子是Zobel等人发表的探针载体中的附加序列。  2015),并且不会替换原始结构的任何序列。 根据其组成命名构建体,即在14f_80i启动子中,将14f克隆在80i间隔子的上游。

  Tn7转座子的基因组整合后,所有菌株均在BioLector系统中进行了表征。

  没有启动子的单个启动子控制达到了与Zobel等人最初描述的活性相当的活性。 相反,在上游或下游与80i间隔子结合的单个启动子的活性受到很大影响。 随着间隔子的下游放置,所有启动子均受到不利影响,在14f_80i上下降高达70%。 相反,在间隔物的上游位置无法观察到明显的趋势,大多数组合的活性降低了多达28%,但80i_14c的活性提高了12%,80i_14d的活性甚至降低了50%。

  这些结果表明,间隔子对所有测试的启动子都具有巨大作用。 尽管间隔子本身不显示任何启动子活性,也不包含任何可能影响启动子活性的可辨别序列,例如富含ATUP元件。 另外,间隔件的上下游影响是不可预测的。 当与间隔子结合时,大多数单个启动子显示出降低的活性,这可以通过缺少可能存在于原始构建体中的上游激活元件(例如富含ATPacI限制性位点)来解释。 虽然无法确定间隔子位置与启动子活性之间的一致性,但结果确实证实了以下基本假设:启动子的活性受间隔子影响。

  研究假设了如何影响这些堆积的启动子的两种可能方式。一是间隔子对启动子的影响。二是一个启动子对另一个启动子的相互影响。 为了检验这些假设,我们构建了14种不同的堆叠启动子组合和12个对照,以确定80i间隔子对单个启动子活性的影响。 遵循SEVA提供的规则,启动子整合在限制性酶切位点PacIAvrII之间。 间隔子是Zobel等人发表的探针载体中的附加序列。根据其组成命名构建的表达框,即在14f_80i启动子中,将14f克隆在80i间隔子的上游。

  首先验证了间隔子序列对启动子的影响。

  Tn7转座子的基因组整合后,所有菌株均在BioLector系统中进行了表征。

  没有启动子的单个启动子控制达到了与Zobel等人最初描述的活性相当的活性。在上游或下游与80i间隔子结合的单个启动子的活性受到很大影响。 随着间隔子的下游放置,所有启动子均受到不利影响,在14f_80i上下降高达70%。 相反,在间隔物的上游位置无法观察到明显的趋势,大多数组合的活性降低了多达28%,但80i_14c的活性提高了12%,80i_14d的活性甚至降低了50%。

  这些结果表明,间隔子对所有测试的启动子都具有巨大作用。 尽管间隔子本身不显示任何启动子活性,也不包含任何可能影响启动子活性的可辨别序列,例如富含ATUP元件。 另外,间隔件的上下游影响是不可预测的。 当与间隔子结合时,大多数单个启动子显示出降低的活性,这可以通过缺少可能存在于原始构建体中的上游激活元件(例如富含ATPacI限制性位点)来解释。 虽然无法确定间隔子位置与启动子活性之间的一致性,但结果确实证实了以下基本假设:启动子的活性受间隔子影响。

  接下来验证堆叠的启动子是否也互相影响,在有七个校准的启动子的下游加上间隔子下和14g启动子。 作为对照,补充了反序组合14g_80i_14a。 正如上述结果所预期的那样,所有这些组合导致的活性远低于忽略上下游效应的单个启动子总和所预期的活性。 有趣的是,仅在启动子顺序上不同的组合14a_80i_14g14g_80i_14a达到了完全不同的活性。 在克隆这些堆叠组合的过程中,意外地创建了一个由两个14f和一个14g序列(由两个间隔区分隔)组成的三联'ffg'启动子,其中第二个14f-35-10元件之间短了两个核苷酸。 从该启动子推导序列功能关系可能太复杂了,但事实是它比最强的启动子组合14g_80i_14g强约45%,这使其在需要非常高表达的应用中很有用。

  当将这些堆栈的活性与上述单个启动子-间隔子对照进行比较时,很明显单个启动子是预测启动子活性的主要决定因素。 对于14g_80i_14a组合,单个启动子活性的总和大大高出了堆叠启动子的活性140%。 相反,特定于上下文的控件的总和提供了更加准确的预测,即14g_80i + 80i_14a = 14g_80i_14a。 在这种情况下,针对所有测试组合,特定于上下文的预测和实验值之间的方差系数低于15%。 这有力地表明,一旦充分考虑了单个启动子的直接环境,堆叠的启动子就不会影响彼此的活动。

  考虑到构建的表达框可能会产生不同的5'-末端mRNA末端,在报告基因构建物中包含了双顺反子设计。 为了验证受上下文影响的构建体表达的改变是否是由于转录增加引起的,我们对所选构建体进行了定量实时PCRqRT-PCR)。 确定的转录水平与源自荧光测量的启动子活性高度相关,这证实了间隔子影响转录而不是翻译。

  最后通过设计单核苷酸多态性突变库发现启动子序列本身并不会引起上下文相关的效应,这表明其他因素(例如不同的转录起始速率)正在发挥作用。

 

(徐毅诚摘译)


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