合成生物催化剂摘译自:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00163

      古生菌、细菌与其对应的噬菌体之间的斗争从过去延续至今。CRISPR是原核生物中发现的第一种,也是迄今为止唯一的适应性免疫,是一种灵活的抗噬菌体机制,既可以记忆过去遭遇的侵染,又可以应对随时间衍生出的新噬菌体。CRISPR作为适应性免疫机制的关键是自我与非自我识别的能力。 然而,不同的CRISPR系统在区分外来基因片段与自身基因片段方面差异很大。

      近日分别来自马里兰大学和南加利福尼亚大学的ake L. Weissman Philip L.F. Johnson Trends in Microbiology上发表的一篇名为Avoidance of Self during CRISPR Immunization的综述向学界介绍了crispr系统敌我识别机制方面的研究进展。

      综述将CRIPSR的敌我识别机制分为两大类:(i)直接由Cas采集机制决定的、偏向于从外源片段获取间隔子的识别机制。以及(ii)由宿主的生态或进化动力学的其他方面间接产生的敌我识别机制。 我们归纳了敌我识别机制的多样性,发现在间隔子获取过程中存在许多涉及广泛但缺乏通用性的敌我识别机制。

      某些CRISPR系统更喜欢从细胞内主动复制的序列中获取间隔子,有研究证明了CRISPR对细胞内游离DNA末端的偏好。 因为停滞的复制叉通常会在DNA中产生双链断裂(即自由端),并且由于高拷贝病毒和质粒会在细胞中提供比宿主基因组更多的这些复制叉,这对于crispr系统来说是一个强有力的信号。 此外,当发生断裂时,RecBCD蛋白会被募集并逐步降解DNA,直到到达Chi位点,这会产生更多的游离片段,这些游离片段就容易被当成间隔子采集的目标。 诸如质粒和病毒之类的移动遗传元件通常缺少这些Chi位点,这意味着降解将沿其基因组继续进行,进一步加剧了由此产生的间隔子获取。估计在获取间隔子的过程中,质粒相比宿主DNA被获取间隔子的概率是1001000倍。

      对游离DNA末端的偏好可能是CRISPR系统在间隔子获取过程中存在的普遍特征,这种偏好已经在多种II-A型链球菌系统中通过实验观察到。与之相似的,I-G型和III-B型效应子模块一起编码的激烈热球菌(Cyrococcus furiosus)采集模块似乎偏好从容易出现双链断裂的区域采集间隔子。

      尽管如此,使用嗜热链球菌DGCC7710 II-A CRISPR1系统进行统计时,发现从宿主基因组中获得间隔子的频率很高,没有明显的外源基因偏好。 这是一个令人困惑的结果,因为最近显示来自同一菌株的II-A CRISPR3型基因座更倾向于游离DNA末端。 嗜热链球菌的CRISPR1CRISPR3基因座在功能上可能完全不同(毕竟,它们的确有不同的获取率)。 我们认为,更有可能的是,实验中使用的间隔子靶标其特征会影响间隔子获取的偏好。 具体的说,嗜热链球菌DGCC7710 II-A CRISPR1系统间隔子获取实验使用的靶标是低拷贝质粒(每个细胞约3拷贝,与其他研究使用的烈性噬菌体在自身特性上有所区别)。 在这种情况下,由于质粒复制子的数量与宿主复制子的数量相似,因此我们推测低拷贝质粒不容易触发DGCC7710 II-A CRISPR1系统的间隔子获取的偏好。 按照这种理论,我们认为病毒或质粒在细胞内繁殖的速度越快,产生的复制子就越多,因此间隔捕获的可能性就越大。 因此,与高拷贝质粒或裂解病毒相比,文章推测大型低拷贝质粒和溶原性噬菌体与活性CRISPR系统共存更长的时间。同样的,增值速度较快的宿主比生长缓慢的宿主更容易出现CRISPR靶向自身基因组的情况。 实际上,这可以部分解释为什么CRISPR在生长缓慢的生物中更为普遍(例如,极端微生物,某些古细菌,厌氧菌[50,51])。 与此相关的是,我们希望CRISPR在间隔子获取时能尽量避开对采用滚环复制(每个基因组只有一个复制叉并且可以连续复制)的移动遗传元件(比如质粒)。但是,与我们希望的相反,在某些质粒中,滚环复制可能会促进间隔区的获取,这可能是由于CRISPR对复制起点上的DNA切口的依赖性。

 

      在感染过程中,许多病毒破坏了宿主的转录过程,这种情况下病毒基因被高速转录,宿主基因表达被下调。 在这种情况下,直接从RNA中获取间隔子的系统会更容易获取病毒间隔子。 仅在某些III型系统中通过实验观察到了从RNA捕获间隔子过程,其中cas捕获机制与逆转录酶相关,但是生物信息学证据表明,靶向RNAVI型系统也可能直接从RNA捕获间隔子。 即使在从DNA中获得间隔子的系统中,也已观察到间隔子获取更偏好高拷贝基因。 据推测,转录可能使DNA在物理上更容易被Cas蛋白识别,或可能导致双链断裂。

       CRISPR对自由DNA末端的偏爱还可能是与先天免疫系统(特别是限制性修饰(RM)系统)协作的结果。RM系统已经显示出可以增加间隔子的获取率,并且在跨物种广泛观察时也倾向于与CRISPR共同作用。 CRISPR-RM协同作用将使间隔区的获得受益于RM系统强大的敌我识别功能(基于甲基化模式),并且可能非常普遍,因为绝大多数原核生物编码至少一个RM系统。

      如果间隔子能在CRISPR系统中长期存在,那么这类间隔子对于搭载CRISPR系统的菌体来说便是绝对安全的(假设选择已清除了种群中的所有自我靶向间隔子)。 尽管当菌体遇到全新的外来片段时,这类间隔子可能是无用的,但是在持续进行的协同进化竞争的背景下,预先存在的免疫记忆可能非常有用。 例如,病毒经常与宿主共同进化以克服CRISPR免疫靶向。 病毒原型间隔子或PAM中的单个突变足以完全阻止CRISPR靶向。 主机如何在快节奏的协同进化动态中保持与时俱进? 事实证明,当外源序列编码一个在宿主的CRISPR阵列中具有部分或完全匹配的原型间隔子时,许多CRISPR系统就能快速更新其免疫靶向。这种启动将极大地改善CRISPR针对外援入侵片段的能力。

       从机理上讲,间隔子更新依赖于CRISPR对自由DNA末端的偏好。  CRISPR免疫活性产生的DNA片段成为Cas采集机制整合间隔子的基础。即使是部分序列互相匹配也可能降低游离片段的降解率并刺激间隔物的获取。

       引物是一种普遍的现象,并已通过实验观察到其作用于IB型,IC IE IF II-A  CRISPR 系统。 生物信息学证据表明,II-C型系统也可能具有启动功能。

       III型系统在靶向过程中对错配具有相当的耐受性,因此不太可能需要启动来克服病原体的协同进化,这也许可以解释为什么迄今为止在这些系统中尚未观察到启动现象。

       尽管该机制在I型和IICRISPR系统中具有普遍性,但在不同的系统亚型间重要差异。 系统之间存在特定的引发捕获链和空间偏好,这可能是由于I型核酸内切酶Cas3沿着DNA进行性移动,而II型核酸内切酶Cas9仍然偏好游离链。 这些差异也可以从PAM依赖性方面看出,其中II-A型系统中的启动依赖于完整的PAM序列的存在,而完整的PAM序列是核酸内切酶活性产生片段状底物进行采集所必需的[37] 相比之下,在I-E型系统中观察到了不依赖PAM的引发,其中识别缺乏适当PAM的原型间隔物靶标会导致Cas3募集,从而抑制了核酸内切酶活性。 募集后,Cas3充当分子马达并沿着DNA链进行性移动,从而潜在地促进了距原始原型间隔物很远的区域的间隔区吸收。

       最后,启动作为自我与非自我识别机制的效果如何? 在一种类型的IF研究系统中,启动现象促使间隔子获取产生了强烈的外源偏好(外源序列间隔子获取频率比内源序列间隔子获取频率的获取高500倍),但是对部分错配的容忍导致了CRISPR系统中针对内原序列的间隔子数量增加。 因此,启动现象虽然会极大地促进CRISPR系统获取外源片段间隔子,但同时可能不会影响甚至可能增加内源间隔子获取的绝对速率。

      尽管不经常将cas基因视作CRISPR系统敌我识别系统的要素去讨论,但cas基因通常会在感染或可能发生感染的条件下上调。 这相当于一种基于时间的外源间隔子获取偏好,将间隔子采集行为限制在细胞中可能存在外源DNA的时期。 但是,在整个系统和宿主物种中,表达模式是可变的。cas基因可以响应各种刺激而上调,这些刺激可能对应于感染风险的增加,包括营养物浓度,温度和宿主密度。如何调节CRISPR以便宿主能够动态控制感染风险仍然是一个谜,但是正在开发有前途的新方法来快速,准确地测量cas基因在一系列遗传背景和生态环境中的表达。

       我们希望针对CRISPR系统的诱导与感染相关联,这些指标可能会因环境和生物分类而异。 当很少发生病毒(或质粒)感染时,诱导对于敌我识别特别重要,因为在所有其他时间,间隔区获取的唯一底物将是宿主基因组。如果病原体暴露时间随时间而变化,则宿主可以通过采用将诱导与各种机制相结合的策略来最大化其敌我识别的能力。值得注意的是,cas基因通常以单个操纵子的形式被发现,并且经常被共转录。 这暗示了Cas间隔子获取和效应物复合物在表达时间上的偶联关系,这与在感染增加时菌体会上调CRISPR系统表达并促进间隔获取的猜想一致。

      如果能通过水平传递来传递间隔子,将极大地提升CRISPR系统的抗病毒性能。即种群中站立的间隔物多样性已经经历了针对自靶向间隔物的强烈选择。但是如果存在,那么这种机制仅在间隔子序列横向转移非常频繁的情况下才能惠及菌群。但这似乎是事实。CRISPR阵列非常不稳定,间隔区可以通过阵列之间的重组来转移。间隔子和病毒基因组之间的同源性实际上可以帮助这些阵列通过转导实现扩散。实际上,甚至有人提出重复在整个系统中是高度保守的,特别是通过同源重组来帮助间隔物在阵列之间的水平转移。显然,这些间隔子仅在它们来自共享病毒病原体的个体(通常在同一物种中)时才有用。

 徐毅诚 摘译


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