合成生物催化剂摘译自https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00440

  Cripsr cas9是一种广为流传的基因组编辑工具,关于cas9系统在真核生物中编辑效果决定因素的研究有很多,但关于cas9在大肠杆菌中编辑效果决定因素的相关研究却很少。

 

  近日,来自科罗拉多大学博尔德分校的Ryan T. Gill团队在ACS合成生物学杂志上发表了一篇名为《Determinants for efficient editing with Cas9-mediated recombineering in Escherichia coli》的文章。研究了编辑位点,Cas9表达水平,sgRNA间隔序列和细胞生长条件对cas9编辑效率的影响。

  文章首先设计了35sgRNA,其中16个靶向galk基因,其他的19个靶向其他基因,以无靶点sgRNA为参照,对比致死效率,发现致死效果最好的sgRNA相对于无靶向作用的sgRNA其切割后的菌落数差了四个数量级(104倍)文章据此将sgRNA分为三组,将致死效果相对于无靶向作用的sgRNA超过三个数量级的(103倍)的15sgRNA归为第一组,相差在一个数量级以内的9sgRNA归为第三组,其余11sgRNA归为第二组。统计结果现实多数的强致死sgRNA具有较高的编辑效率,但是并非所有的强致死sgRNA都具备相近的编辑效率。

 

    随后,文章检测了高致死sgRNA介导的cas9编辑在基因组不同位点上的编辑效率差异,先以敲除galk的大肠杆菌为底盘细胞,分别在七个不同的基因组位点上插入了galk基因,以敲除不同位点galk基因的效率差异评估了不同分组sgRNA的编辑效率。结果发现高致死率组(第一组)sgRNA的编辑效率随微店变化不大,中低组(第二、三组)sgRNA的编辑效率随位点与基因组复制末端的距离越远编辑效率相对越高(第三组未严格遵循此规律,但确实是距离复制末端最远的sgRNA编辑效率最高)

 

  

  然后文章测定了不同强度启动子对cas9编辑效率的影响、通过对未编辑细胞的深度测序分析了cas9编辑过程中的编辑逃逸机制。

  最后发现cas9启动子强度对应的编辑效果会因为sgRNA致死效率差异而异;约92%的未编辑细胞在sgRNA靶向位点上存在PAM区突变,约81%的细胞在sgRNA靶向位点上存在PAM区和N20区突变。只有约10%的细胞仅突变了PAM位点。Cas表达量的提升会导致脱靶概率提升,而由于逃逸机制幸存的细胞数量则是相对恒定的,因此使用高致死率的sgRNA引导cas9时,编辑效率随cas9表达量提升而下降。并且发现细胞生长速率越慢(文章选用了对数生长期的细胞和刚刚抵达平台期(OD600=2.5)的细胞做了对比)越有利于中、低强度致死率sgRNA介导的cas9编辑。因为细胞生长影响了Red重组和cas与靶序列的结合以及切割。

  总的来说,sgRNA设计的越好(致死率越高)编辑效果就越有保障。

(徐毅诚摘译)

 

 


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