合成生物催化剂,摘译自:https://www.nature.com/articles/s41589-020-0518-9

CRISPR蛋白是控制CRISPR–Cas技术的强大工具。但是,可用的CRISPR蛋白种类有限,仅限于自然界存在的变体。

瑞士洛桑联邦理工学院生物工程研究所Bruno E. Correia教授和德国海德堡大学BioQuant中心合成生物学小组Dominik Niopek教授在Natural Chemical Biology上发表文章:Computational design of anti-CRISPR proteins with improved inhibition potency。在这项工作中,作者应用蛋白质工程设计人工CRISPR蛋白这些新合成的蛋白对来源不同的多种Cas9表现出增强的抑制效果

者从抗CRISPR蛋白AcrIIC1出发,这是一种广谱的II-C 型Cas9抑制剂,对来自脑膜炎奈瑟菌、硬脂嗜热杆菌和空肠弯曲杆菌的Cas9均有抑制效果。AcrIIC1能够紧密地结合Cas9保守的催化结构域HNH,而将Cas9锁定在一种DNA结合能力强但催化活性不高的状态,作者猜测这可能是AcrIIC1抑制作用不强的原因。因此作者推测在AcrIIC1中插入外源性结构域来干扰Cas9-sgRNA复合物中各组分的构象自由度或稳定可能会提高抑制作用。作者选定了AcrIIC1中离与HNH结合的结构域较远的Loop5区域来嵌合外源结构域。通过筛选发现在AcrIIC1的loop5区域表面位点嵌合mcherry可显著增强对脑膜炎奈瑟菌NmeCas9的抑制,其抑制效果胜过天然存在的对NmeCas9抑制作用最强的抗CRISPR蛋白AcrIIC3

随后作者将这种策略应用于更具临床重要性的金黄色葡萄球菌Cas9。金黄色葡萄球菌来源的SauCas9是一种II-A型CRISPR效应物,被广泛应用于体内基因组编辑。由于其尺寸小可以很容易地被包装进CRISPR疗法的主要候选载体腺相关病毒颗粒中。由于SauCas9的HNH结构域与NmeCas9相似,作者以AcrIIC1作为出发蛋白进行进化,通过Rosetta设计和人工复查确定了10个可能使AcrIIC1SauCas9的HNH结构域结合更紧密的突变。随后对这些突变进行单独测试和迭代筛选。最后通过3轮筛选,得到一个 AcrIIC1N3F, D15Q, A48I)的三重突变体,称之为AcrIIC1X。随后作者对AcrIIC1X的性能进行了详细的表征,结果发现AcrIIC1X有效抑制了所有测试位点的SauCas9基因编辑。

最后,为了证明AcrIIC1X在基因组工程应用方面的巨大潜力,作者使用AcrIIC1X将SauCas9活性限制在选定的细胞类型上。作者通过将AcrIIC1X表达置于microRNA-122的调控下,实现了一个肝细胞特异性SauCas9开关。microRNA-122仅在肝细胞中表达的细胞特异性的microRNA(miRNA)使肝细胞中CRISPR蛋白表达脱靶。因此在没有miR-122 (OFF状态)的情况下,编辑被有效抑制,而在有miR-122 (ON状态)的情况下,编辑几乎被释放到阳性对照的水平。

文的工作向我们介绍了人工设计的抗CRISPR蛋白可作为重要的生物技术工具,并提供了保障CRISPR技术的创新策略。

 

(杨佳玮 摘译)


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