合成生物催化剂  摘译自:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00143

    大肠杆菌是重要的工业生物,具有生长速度快,能进行高密度发酵等优点,然而如何解除大肠杆菌生长-代谢的耦连,将物料更高效的转化为产品,始终是一个困扰工业界的问题。

   近日,来自丹麦技术大学的Alex Toftgaard Nielsen团队ACS Synthetic Biology上发表了一篇名为《Genome-wide CRISPRi-based identification of targets for decoupling growth from production》的文章借助CRISPRi技术对大肠杆菌基因组进行了分析,试图找出抑制哪些基因的表达能解除生长-代谢的耦连,减少工业微生物在菌体量增长方面的代谢分配,提高培养基到目标代谢物转化效率。

利用四环素诱导启动子同时诱导dcas9蛋白和对应的sgRNA文库表达来实现对目标基因座的抑制。实验通过诱导、不诱导、间歇性诱导三种策略结合流式细胞仪筛选技术,对细胞生长和代谢物(文中使用的指示物为绿色荧光蛋白)积累进行了分析。

最终发现靶向sibB / ibsBygaQmalZyjeN yaiYp),ydiBlpxCglcAcasC的表达抑制,显着抑制了生物量的增加。其中除lpxC基因外,其余基因对细胞体积的影响较小,细胞体积的增大倍数不足1.5倍。对yheVsibB / ibsB两个基因的表达抑制表现出了最高的荧光增长量,分别增加5.5倍和5.1倍。 但是靶向yheVsgRNA没有显示出生长停滞,而靶向sibB / ibsBsgRNA却显示出细胞密度降低了45

但是由于意外的抑制或脱靶作用,表达靶向特定基因的sgRNA并不总是起到沉默或抑制该基因的作用。 此筛选没有考虑到sgRNA表达引起的任何意外抑制作用,而只是识别了可作为生长开关的sgRNA。 因此,对于在文库中鉴定的sgRNA的一部分,相应的基因可能无法用作生长解偶联靶标。

意料之外的sgRNA抑制作用可能包括减少GFP的蛋白水解降解,稳定mRNA或改善蛋白质成熟。 如lpxC的抑制使得细胞大小增加了近3倍,这些导致细胞大小增加的基因,间接地导致了更高的荧光蛋白质含量。

 

 

(徐毅诚摘译)


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